单位文秘网 2021-08-10 08:09:31 点击: 次
摘 要目的:使标本具有形态结构完整性,并且具有较长时间保存。方法:直接接种培养和直接染色并且同时封片。结果:颜色鲜艳,真菌孢子不易脱落,菌丝和孢子具有保持自然形态,同时具有封片保存功能。结论:方法操作简便、易把握。由于染色液内具有粘合性作用,使着色和封片同时进行。
关键词真菌;小培养;聚乙烯醇;曲本利兰
中图分类号RT文献标识码A文章编号1673-9671-(2010)101-0110-01
真菌由菌丝和孢子构成,孢子是真菌的生殖结构,分为有性孢子和无性孢子,真菌分为浅部真菌和深部真菌。根据真菌特殊的菌丝和孢子形态来确定真菌的种类。真菌的种类很多,在自然界分布极广,它的形态结构复杂,菌丝体和孢子的形态特征随真菌种类不同而异,是鉴别真菌的重要依据。真菌标本其目的主要是在于真菌的形态结构完整性和着色清晰而又长久保持鲜艳,为了提高教学质量,本作者在原有几种方法基础上作了一些改进。
1材料与方法
1)菌种:青霉菌、黄曲菌、毛霉菌、孢子丝、等,以上菌种均为本实验室保存提供。
2)染色液的配制:A液:①聚乙烯醇(PVA-124)3.6g,②蒸馏水50ml。(将①加入20度冷蒸馏水中搅拌逐步加温到95度);B液:①石碳酸25ml;②乳酸25ml;③曲本利兰0.5g(将①、②、③混合溶解),染色时将A液B液等量混合。聚乙烯醇溶解时,可边搅拌边将本品缓缓加入20℃左右的冷水中充分溶胀、分散和挥发性物资的逸出(切勿在40℃以上的水中加入该产品直接进行溶解,以避免出现包状和皮溶内生现象),而后升温到95℃左右加速溶解,并保温2~2.5小时,直到溶液不再含有微小颗粒,再经过28目不锈钢过滤杂质后,即可备用。
3)沙保弱培养基:①葡萄糖4g;②蛋白胨2g;③琼脂1.8g;④蒸馏水100ml将①、②、③、④、混合放置150ML三角烧瓶内包扎好瓶塞,高压蒸汽10磅10min灭菌。本培养基不需校正pH。本培养基是真菌常规本培养基。
4)小培养法:在无菌条件下,用无菌毛细滴管吸取已融化的沙保弱培养基,快速地放入已消毒的盖玻片上1滴,等凝固后用无菌接种针取真菌菌种少许穿入培养基中,然后将盖玻片的标本反过来放入已消毒的载物玻片中,然后,将此片子放入干净的培养皿中,培养皿底部放入潮湿的吸水滤纸,或者将培养皿底放入一些水,中间用玻璃棒隆起,将做好的培养片子搭放在上面,在25℃~28℃温箱培养,在72-96h取出染色。
5)标本处理和染色:将培养好的真菌片子取出,用小镊子轻轻地取下上面的盖玻片,把盖玻片转放于另一干净的载玻片上,将已培养的培养物分别放入70%、75﹪、85%、95%、100%酒精脱水,每种酒精浓度脱水5min,经酒精脱水后培养物正面放入载物玻片上直接滴入2滴曲本利兰真菌染色液,然后盖上盖玻片,自然干燥封片。24小时后用高倍镜观察其鲜艳的颜色和清晰的结构。
2结果
菌丝和孢子呈兰色,颜色鲜艳,真菌孢子不易脱落,菌丝和孢子具有保持自然形态,同时具有封片保存功能(由于PVA具有独特的强力粘接性、保护胶体性、气体阻绝性等特性有利于标本长久保持)。1986年制作几批的标本现在镜下乃观察可见真菌菌丝体和孢子形态保持自然完整,孢子基本没有脱落。
3讨论
真菌菌落一般有三种类型:
1)酵母型菌落,为单细胞真菌的菌落,形态与一般细菌菌落相似,以出芽形式繁殖,如新型隐珠菌。
2)类酵母型菌落,外观似酵母菌落,但可见伸入培养基中的假菌丝,它是由伸长的芽生孢子形成,如白色念珠菌。
3)丝状菌落,为多细胞真菌的菌落,由许多菌丝体组成。菌丝多数有隔分成多个细胞称有隔菌丝,有的菌丝无隔,称无隔菌丝。真菌直接检查方法是,浅部感染真菌的病变标本如毛发、皮屑、甲屑置玻片上,滴加10%KOH,覆盖玻片微热熔化角质层,再将玻片压紧,用吸水纸吸去周围多余碱液,在显微镜下观察,见皮屑甲屑中有菌丝,或毛发内部或外部有成串孢子,即可初步诊断为癣菌感染,但不能确定菌种。深部感染真菌标本如痰,脑脊液亦可做涂片用革兰氏染色(白色念珠菌)或愚汁负染色(隐球菌)观察形态特征。真菌的菌丝一般是无色的,因此,在观察其形态时,要用染色液进行染色观察,一般的染色液如结晶紫染色液不适合用来进行真菌染色观察。在这些染色液中,真菌菌丝容易集结成团,不易分开,影响观察,而且菌丝收缩,影响观察结果。常用的真菌染色液包括以下2种:①乳酸酚酸性复红:苯酚10g,乳酸10g,甘油20g,蒸馏水10ml,酸性复红0.5g,将水与酚混合直到溶解,然后加入乳酸和甘油,最后加入酸性复红。②棉蓝染色液:苯酚10g,乳酸10g,甘油20g,蒸馏水10ml,棉蓝0.025g。
本实验用曲本利兰真菌染色法,特点是直接接种培养和直接制片,使标本具有形态结构完整性。由于本制作的染色液内具有粘合作用,使着色和粘合同时进行,使标本具有严格封闭和长久保持着色清晰新鲜的结构(菌丝各种孢子)的优点。以往都是切割琼脂块先染色后加胶封片,操作既烦琐,标本又不点型且不易长期保存。本制作法于1986年制作几批的标本至今乃是保持着清晰新鲜的形态和完整结构,镜下观察可见真菌菌丝体和孢子形态保持自然完整,孢子基本没有脱落。
参考文献
[1]李凡,刘晶星,等主编,医学微生物学.北京:人民卫生出版社,2008.
[2]刘毅华等主编.医学免疫学微生物学实验与习题.武汉:武汉大学出版社,1993.
[3]项裕财.真菌标本制作改良法.佳木斯医学院学报,1996,19(1):68.
(责任编辑:单位文秘网) )地址:https://www.kgf8887.com/show-117-83007-1.html
上一篇:《兽医微生物学》实验教学改革研究
下一篇:微生物检验在控制医院感染中的作用
版权声明:
本站由单位文秘网原创策划制作,欢迎订阅或转载,但请注明出处。违者必究。单位文秘网独家运营 版权所有 未经许可不得转载使用