单位文秘网 2021-08-18 08:56:47 点击: 次
摘要:为了提高污水中氮素的去除效率,本研究自某大学微生物实验室开发的处理大豆乳清废水厌氧出水的CAAC(Continuous Aerobic-anaerobic Coupled)反应器污泥中筛选出1株高效好氧反硝化菌AD-1,经 16S rDNA序列同源性比较和系统发育分析初步鉴定为恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)。通过摇瓶批次培养考察菌株AD-1对以硝酸盐为唯一氮源的DM反硝化培养基的脱氮性能。48h 时AD-1的TN和NO3-N去除率分别达到63.31%和63.35%,NON浓度虽始终处于较低水平却呈高低波动状态,培养后期CODcr /TN下降是限制AD-1反硝化效率的主要因素之一。AD-1处理大豆乳清废水厌氧出水时NON去除率接近100%,具有较高效的反硝化特性。结果表明,该菌株可作为处理大豆乳清废水厌氧出水及其它含氮废水的生物强化剂。
Abstract: To increase nitrogen removal efficiency, the study screened a high-efficiency aerobic denitrifier AD-1 in the activated sludge originated from a university previous designed CAAC(Continuous Aerobic-anaerobic Coupled)reactor treating SWWAE(Soybean Whey Wastewater Anaerobic Effluent). The strain was identified as pseudomonas putida according to the 16S rDNA sequence homology comparison and phyletic evolution analysis. The denitrification efficiency of Pseudomonas putida AD-1 was analyzed in DM medium feeding nitrate as the sole nitrogen source by shake-flask batch culture. After 48h the TN and nitrate removal rate reached 63.31% and 63.35%, respectively. Nitrite concentration was always at low level but fluctuated. At the later culture stage the low CODcr/TN ratio was one of main rate-limiting factors. AD-1 had high-efficiency denitrification with 100% nitrate removal rate in the process of treating SWWAE. Results indicated that AD-1 was a good bioaugmentation agent for SWWAE and other nitrogenous wastewater treatment.
关键词:大豆乳清废水厌氧出水;好氧反硝化菌;恶臭假单胞菌AD-1;硝态氮还原酶系;亚硝态氮还原酶系
Key words: SWWAE(Soybean whey wastewater anaerobic effluent);aerobic denitrifiers;pseudomonas putida AD-1;nitrate reductase;nitrite reductase
中图分类号:G31文献标识码:A文章编号:1006-4311(2011)11-0008-03
0引言
脱氮一直是水环境污染治理中的一大难题,随着大豆深加工业的发展,大豆深加工乳清废水的排放量与日俱增,乳清废水中含有的大量CODcr、NH3-N、NO、NO难以及时、有效地处理,由此引起的水体富营养化及养殖水产动物中毒等现象日趋严重。作为目前公认的废水脱氮处理中最经济、最有效的生物脱氮技术成为研究的热点[1,2]。传统生物脱氮采用好氧硝化-厌氧反硝化组合工艺,硝化作用在好氧的条件下将氨转化为NO/NO,反硝化作用在无分子氧的条件下利用有机物作为碳源,NO/NO作为能量代谢中的电子受体,O2-作为氢受体,合成自身物质或生成N2和H2O,进而达到脱氮的目的。大量的厌氧反硝化菌如Achromobacter, Aerobacter, Bacillus, Brevibacterium, Flavobacterium, Lactobacillus和 Pseudomonas[3]等只有在缺氧或厌氧条件下反硝化基因得以表达,但是其代谢缓慢,脱氮效率低,并且好氧菌与厌氧菌的空间分离培养也增加了脱氮工艺的成本[4,5]。而好氧反硝化菌(Aerobic Denitrifier,AD)和好氧反硝化酶系的发现极大推进了生物脱氮的研究,并受到国内外学者的广泛关注[6,7]。AD可以在有氧条件下以有机物为电子供体,并且同时以O2和NO/NO为电子受体,产生氮气。目前已报道的好氧反硝化菌有Alcaligenes faecalis, Citrobacter diversus, Pseudomonas stutzeri和Thiosphaera pantotropha等[8,9,10]。AD可以在同一空间内实现同步硝化-反硝化,避免了系统运行过程中pH的调节,节约了污水处理系统运行成本,而且克服了厌氧反硝化菌生长缓慢,脱氮效率低的缺点[11,12],为高浓度含氮废水的处理提供了一条新途径。
某大学微生物实验室前期设计开发了处理大豆乳清废水厌氧出水的CAAC反应器[13],由移动床生物膜反应器(MBBR)和好氧-厌氧耦合反应器(AAC)串联组成,反应器在室温条件下稳定运行近一年,CODcr去除率大于95%,TN去除率高于80%,具备良好的脱氮性能。本研究从中筛选出1株高效好氧反硝化菌,通过16S rDNA方法鉴定菌株的种属关系,并通过摇瓶批次培养分别考察菌株AD-1对以硝酸盐为唯一氮源的DM培养基和大豆乳清废水厌氧出水的反硝化脱氮性能,以期更好地服务于含氮废水的工程应用。
1材料与方法
1.1 培养基①SM培养基(/L):柠檬酸钠8.5g,NaNO30.85g,KH2PO41.36g,(NH4)2SO40.27g,Yeast extract 1 g,MgSO4•7H2O 0.19g;
②溴百里酚蓝(BTB)培养基(/L)[14]:L-天冬酰胺 1g,NaNO31g,KH2PO41g,FeCl2•7H2O 0.05g,CaCl2•2H2O 0.2g,Mg2SO4•7H2O 1g,BTB(1%溶于酒精)1 mL,琼脂20 g,pH7.0~7.3;③LB液体培养基(/L): Yeast extract 5g,蛋白胨10g,NaCl 10g;④DM培养基(/L):KNO3 0.6g,KH2PO4 1g,MgSO4•7H2O 1g,柠檬酸钠 9.63g。
1.2 实验方法
1.2.1 好氧反硝化菌的富集、分离及脱氮性能测定污泥取自北京理工大学生命学院微生物实验室运行的处理大豆乳清废水厌氧出水的CAAC反应器。投加4g污泥至100mL SM培养基中,置于30℃,170rpm摇床中进行好氧反硝化菌富集培养。48h后取出4mL菌悬液至100mL新鲜SM培养基中在相同条件下培养,如此重复3次。将菌悬液梯度稀释后涂布于BTB平板培养基中,置于30℃培养箱中培养至长出单菌落,挑取蓝色单菌落划线于LB固体斜面培养基,4℃保存。挑取已保存菌落接种至50mL LB液体培养基中,30℃、170rpm振荡培养14h。取4mL菌悬液接种于100mL DM培养基中,30℃、170rpm振荡培养,每12h测定NO3-N、NO2-N、TN及CODCr浓度。
1.2.2 好氧反硝化菌的鉴定菌株总DNA的提取和纯化参照文献[15]。以基因组DNA为模板,采用细菌16S rDNA通用引物(正向引物: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,反向引物: 5’-TACCTTGTTACGACTT-3’) 进行PCR扩增,扩增条件:94℃预变性8 min,94℃变性1min,50℃退火30s,72℃延伸2min,30个循环后72℃延伸10min。1.5kb左右的PCR产物回收采用赛百盛基因有限公司的硅胶膜型PCR产物纯化试剂盒,纯化产物委托华大基因测序,测序结果在NCBI中比对,挑选数据库中同源性相近的9株细菌16S rDNA序列系统用于进化发育学分析,用MEGA version3软件包中的Kimura 2-Parameter Distance模型计算进化距离,用Neighbor-Joining构建系统进化树。
1.2.3 AD-1对大豆乳清废水厌氧出水的脱氮效率测定取1.2.1 中4mL LB菌悬液接种于100mL大豆乳清废水厌氧出水(取自某大豆深加工企业污水处理厂)中,大豆乳清废水厌氧出水的主要成分分析见表1。30℃,170rpm振荡培养,每12h测定NO3-N、NO2-N及TN含量。
1.2.4 分析方法主要指标分析方法[16]CODCr采用HJ/T 399-2007快速消解分光光度法测定;TN采用GB-T 11894-89碱性过硫酸钾紫外分光光度计法测定;NH4-N采用氨敏电极法测定;NO3-N采用GB 7480-87酚二磺酸紫外分光光度法测定;NO2-N测定采用GB 7493-87 N-(1-奈基)-乙二胺分光光度法。
2结果与讨论
2.1 好氧反硝化菌的分离鉴定通过BTB培养基初筛后得到6株总氮去除率在45%以上好氧反硝化菌,复筛后得到1株高效反硝化菌脱氮效率高于60%,命名为AD-1。图1为菌株AD-1总基因组电泳图,以基因组为模板,以细菌通用引物进行菌株的16S rDNA扩增,扩增出大小约为1.5kb左右的片段,如图2所示。对扩增得到的16S rDNA片段进行测序分析,测得序列大小为1468bp。通过Genbank数据库进行Blast比对并构建NJ进化树,结果如图3所示,可以看出菌株AD-1与假单胞菌属(Pseudomonas)中的Pseudomonas putida同源性达到100%,所以AD-1初步鉴定为Pseudomonas putida。
2.2 AD-1菌的脱氮性能测定考察AD-1菌株在60h内以NO为唯一氮源的DM培养基中的脱氮效率及CODcr/TN随时间变化情况,脱氮效率以TN去除率计,如图4所示。可以看出AD-1在24h内脱氮效率达到53.2%,48h时达到63.31%,而多数已报道的好氧反硝化菌的脱氮能力在50%左右[17,18,19,20]。而培养液中的CODcr/TN随时间变化较大。培养初期(0~12h),CODcr/TN高于60,F/M远远高于微生物生长所需营养,菌体生长代谢旺盛,微生物数量及多种水解酶大量积累;12h后碳源、氮源迅速消耗,CODcr/TN逐渐下降,反硝化效率提高缓慢;48h后CODcr/TN降低至5以下,下降率为89.78%,导致微生物生长及代谢产酶能力不足,反硝化效率趋于稳定。所以培养后期CODcr/TN下降是影响AD-1反硝化效率的主要因素之一。
图5考察了NO3-N和NO2-N浓度变化。NO3-N初始浓度为164.00±5.41mg/L,随着培养时间延长NO3-N去除率逐渐增长,但是受碳源浓度限制,增长率越来越低,48h后去除率达到最高为63.35%。而NO2-N浓度始终保持在较低水平(低于1.6mg/L),与多数文献研究结果一致[20,21],但其浓度变化往往被忽视,本研究发现NO2-N浓度呈高低波动状态,并且振幅越来越小,12h时快速上升至最高值A点而后下降,在48h出现小幅升高至B点的现象。究其原因可能是由于亚硝酸盐还原酶系的产生需要一定浓度的亚硝酸盐诱导。当亚硝酸盐浓度较低时,亚硝酸盐还原酶系产生慢于硝酸盐还原酶系;当亚硝酸盐积累到一定浓度时亚硝酸盐还原酶系被诱导加速分泌,当其还原效率高于硝酸盐还原酶系时,亚硝酸盐浓度减少。亚硝酸盐浓度变化的振幅越来越小是由于后期碳源缺乏,供能不足,导致硝酸盐还原酶系产生减少,亚硝酸盐生成速率下降有关。
2.3 AD-1菌对大豆乳清废水厌氧出水的脱氮效果大豆乳清废水中含有大分子蛋白、小分子寡糖、有机酸、色素类物质和盐类等,而其经厌氧处理后的出水中仍含有较高的COD及一定量的氮素,厌氧出水中的多种复杂成分及酸性条件对微生物生长代谢产生一定影响。本研究考察AD-1菌在大豆乳清废水的中的脱氮效率,结果如图6所示。可以看出AD-1菌对大豆乳清废水中NO3-N去除率在24h时达到近100%,废水中的非NO3-N含量基本不变。表明菌株AD-1在大豆乳清废水中具有较好的反硝化特性,但是其硝化功能较差,所以在实际应用中应协同硝化细菌发挥作用,可应用于同步硝化反硝化(SND)等处理工艺。
虽然AD-1菌具有较高的反硝化脱氮性能,但是受CODcr/TN及DO等多种关键因素影响,所以为了获得好氧反硝化菌株最优的脱氮条件,需要进一步优化以获得最佳CODcr/TN及DO条件,实现AD-1菌脱氮效率最大化。同时,好氧反硝化菌的硝酸盐还原酶系和亚硝酸盐还原酶系的产酶动力学方向也具有一定的研究理论价值。
3结论
3.1 本研究自CAAC反应器的活性污泥中筛选出1株好氧反硝化菌AD-1,经鉴定为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida。
3.2 在摇瓶批次培养24h后AD-1对DM反硝化培养基的TN去除率为53.2%,48h后达到63.31%,具有较好的反硝化能力。NO3-N在48h时的去除率达到最高为63.35%,亚硝酸盐浓度虽然始终维持在较低水平却呈有规律的上下波动状态。
3.3 48h后CODcr /TN降低至5以下,下降率为89.78%,是AD-1菌株反硝化脱氮的关键限速因素之一。
3.4 AD-1菌对大豆乳清废水厌氧出水24h内NO3-N去除率达到100%,具有较好的脱氮效果。
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