单位文秘网 2021-08-20 09:10:32 点击: 次
摘要 [目的]对分离自湖北省大悟县的患病山羊体表脓包中的致病菌进行分析和鉴定,以确定脓包中细菌的分子分类学地位及药物敏感性。[方法]通过对分离株16S rRNA基因序列分析,结合细菌菌落形态和细菌生化特性分析进行细菌分离和鉴定,并对已鉴定的菌株进行药物敏感性试验,筛选出脓包细菌敏感性药物。[结果]从脓包分离的细菌分别为葡萄球菌属、大肠埃希氏杆菌属、不动杆菌属以及绿脓杆菌;药物敏感试验表明这些细菌对药物的敏感性不同,其中对头孢类、喹诺酮类、氨基糖苷类以及氯霉素等敏感。[结论]该研究可为该地区该病流行病学的研究与防治药物的研发提供参考。
关键词 山羊;脓包;16S rRNA;药物敏感性;鉴定
中图分类号 S827 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2014)17-05503-03
Abstract [Objective] Pathogens isolated from pustule of goat surface in Hubei Dawu were analyzed and identified to determine its molecular taxonomic status and drug sensitivity. [Method] Isolates were isolated and identified according to the gene sequence of 16S rRNA, combining with morphological and biochemical characteristics. Then drug susceptibility tests were made to screen sensitive drug strains. [Result] Pseudomonas sp., Escherichia coli, Acinetobacter sp., Lysinibacillus sp. were isolated from the pustules in terms of the identification results; And drug susceptibility tests showed that these bacterias are sensitivity to cephalosporins, quinolones, aminoglycosides, and chloramphenicol. [Conclusion] The study can provide some references for the drug development and epidemiologic study of this area.
Key words Goat; Pustule; 16S ribosomal RNA gene; Drug susceptibility; Identification
山羊体表脓包是由于细菌入侵家畜皮下而引发的严重炎症反应,局部可出现肿大、热痛和某些功能性障碍,严重时细菌及其产生的毒素能够进入血液循环而引起毒血症或败血症。脓汁是机体组织在发生炎症的过程中产生的浓稠或稀薄的渗出物,其中滋生大量的细菌,这些细菌的大量繁殖可造成组织变性坏死,严重时可造成羊群的大量死亡。因此,对脓包内滋生的病原菌的分离、鉴定以及药物敏感性分析,可为该病的深入研究及药物防控等提供一定的理论依据。多种细菌可引起家畜皮下脓包病,如葡萄球菌、大肠杆菌、巴氏杆菌等[1]。有些细菌通过外伤感染家畜;也有部分细菌本身是家畜体内正常的栖息菌,但在环境发生剧烈变化时在诱导期会产生大量的毒素,从而对家畜机体造成损伤。例如,最早从牛脓汁中分离出的化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes),寄生于家畜皮下,常引起牛羊的化脓性感染,并能诱发多种并发症的产生[2]。因此,深入研究家畜皮下滋生的细菌种类及其生化耐药特性等对家畜脓包病的诊断、预防及治疗有重要借鉴意义。根据传统的《细菌鉴定手册》进行细菌的分离鉴定存在一定的缺陷(如生化反应不典型),受外界因素影响而使菌株形态各异等都会造成鉴定结果的差异化。同时,对于一些生长缓慢的菌株,传统的鉴定方法大大增加了鉴定时间和成本。近年来,分子鉴定方法被广泛应用到细菌的分类中,如16S rRNA 是原核微生物中一段相对保守的序列,大小约为1 540个核苷酸,是目前最常被用于细菌分类的核酸序列,故有细菌分类“金指标”之称,其可变区和保守区交替排列使这段序列为细菌鉴定或种间关系预测提供了快速鉴定的依据。笔者利用16S rRNA的保守区设计的引物进行PCR 扩增,将测序结果与NCBI数据库中已提交的细菌16S rRNA序列进行比对,并对鉴定分类后的菌株进行常用药物的的敏感性检测,以寻找这些菌株的敏感性药物。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验样本。从湖北省大悟县3个养殖场随机选择患病山羊,无菌采集山羊体表未破裂脓包中脓汁6份,于4 ℃条件下保存备用。
1.1.2 主要仪器。超净台(AIRTECR);高压蒸气灭菌锅(Systec);恒温培养箱(APLVS);光学显微镜(OLYMPUS25);PCR仪(BioRad);电泳仪(北京六一仪器厂)。
1.1.3 主要试剂。革兰氏染色试剂盒,购自杭州微生物试剂公司;rTaq DNA聚合酶、dNTP、10×Loading buffer、DL2000 Marker,均购自大连宝生物工程有限公司;细菌扩增的通用引物由上海生物工程有限公司合成,引物序列为AF(上游引物):5’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3’;AR(下游引物):5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’[3]。
营养培养基由蛋白胨、牛肉膏、氯化钠和琼脂组成,pH为7.2。血平板培养基由蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂、5%的新鲜去纤维羊全血组成。
药敏纸片:青霉素类(氨苄青霉素、苯唑青霉素、优立新);喹诺酮类(洛美沙星、氧氟沙星);头孢类(头孢羟氨苄、头孢曲松);氨基糖苷类(庆大霉素、卡那霉素);多肽类(杆菌肽);磺胺类(磺胺甲基异恶唑);大环内酯类(红霉素、罗红霉素);糖肽类(万古霉素);呋喃类(呋喃妥因);四环素类(四环素);其他类(氯霉素、利福平、磷霉素)。以上药片均购自北京赛为思生物技术开发中心。
1.2 方法
1.2.1 绵羊皮下脓汁细菌的分培养。将无菌采集的脓汁按照1 ∶100的比例稀释于无菌的生理盐水中,将其充分振荡混匀后,分2组划线接种于营养培养基和血平板培养基上,置于37 ℃恒温培养箱中培养,每隔5 h观察1次菌落形态及数目,根据其菌落表面特征,颜色差异,溶血状态,初步判断细菌种属[4]。分别挑取进行革兰氏染色,镜检鉴定,进行细菌单一种的分离和纯培养。保存单一菌种并进行分子鉴定。
1.2.2 16S rRNA基因相似性分析鉴定。以分离培养的4株细菌DNA为模版,利用细菌的16S rRNA基因的通用引物进行PCR扩增。PCR 反应条件为:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s,55 ℃退火1 min 10 s,72 ℃延伸1 min,35个循环;72 ℃延伸10 min结束。将扩增产物进行电泳分析。将胶回收扩增基因片段,连接至Teasy载体上,转入大肠杆菌感受态细胞JM109(TaKaRa公司),由南京金斯瑞生物有限公司测序,将测序结果与NCBI已提交的序列进行比对分析。
2 结果与分析
2.1 菌落形态学观察
营养培养基及血平板培养基上生长的菌落形态基本相似,均为圆形,边缘整齐光滑,半透明凸起,但存在菌落大小及溶血与否的差异。根据其形态的差异,从中挑取可疑的单菌落,进行革兰氏染色并用光学显微镜进行观察,共从3个脓汁样本中分离出4种形态各异的细菌。
2.2 16S rRNA 测序分析
将4种分离菌进行16S rRNA PCR扩增,其扩增片段大小为1 600 bp左右(图1),与预期片段大小相符。将测序结果与NCBI网站上已提交的序列进行BLAST 比对,结果见表1。
3 讨论
葡萄球菌广泛存在于动物和人类皮肤及粘膜。当外界环境发生变化时,容易造成皮下的化脓感染,从而造成动物皮下脓包的产生[5]。大肠埃希氏菌属及不动杆菌属在许多化脓性感染的病例中均被发现。笔者利用改良后的营养培养基对脓汁样品进行分离培养,根据其16S rRNA序列进行鉴定,共分离鉴定出4个种属的细菌,分别为大肠埃希氏、葡萄球菌属、不动杆菌属以及赖氨酸芽孢杆菌属。
造成细菌性感染的皮下脓肿的原因是多样的(例如日常管理混乱、不注意环境卫生的保护与处理、动物遭受外伤或经人为的非正规无菌操作等),从而使病原入侵、滋生,造成皮下脓肿。目前,针对细菌性感染脓包,以抗生素治疗为主,因此合理选取抗生素的种类对避免该病的反复爆发具有重要意义。在药物选择方面,应尽量选择广谱、价廉、易获取、安全的药物进行治疗,以减少耐药菌株的产生。该研究结果表明4个细菌分离株对于药物的敏感性不尽相同,对头孢类、喹诺酮类、氨基糖苷类以及氯霉素等敏感,可以考虑用以上几类药物配制廉价高效的药物对羊体表脓包进行清洗、预防和治疗。另外,合理安排这几种抗生素的用量及疗程,理论上可以起到较好的治疗效果。
由于不同地理环境条件下可造成不同细菌滋生,因此笔者仅对绵羊体表脓包中的细菌进行分离鉴定及药敏试验。为了理清这4种细菌的致病性研究,今后尚需要进一步研究。另外,以16S rRNA基因为基础建立的细菌鉴定方法也存在一定的缺陷,不同种或同种细菌之间可发生基因水平转移(Horizontal gene transfer,HGT),并且与16S rRNA重组,形成嵌合体[6],从而对基因分析的准确性造成了一定的影响。16S rRNA基因是细菌的通用保守序列,这就对试验的操作过程提出了更高的要求。另外控制各环节无菌操作防止杂菌污染是鉴定结果准确的基本要求。另外,根据序列的相似度进行菌种鉴定,多少范围内判定细菌鉴定到科、属或种的水平,微生物学者们尚未达到共识[7]。这些都需要进一步研究和发展来弥补这些方面的不足。
笔者在有氧的环境中从山羊体表脓包中分离培养了4株病原菌,通过形态学特征进行了初步观察与鉴定后,结合分子鉴定手段对其进行了种属分类,并通过药物敏感性试验分析4个菌属对16种常见药物的抗药作用,这些都为揭示山羊体表脓包的病原组成及防治措施提供了一定的参考。该研究是在有氧的环境条件下进行的,而对脓包中厌氧菌的分类的组成未进行深入研究,同时,笔者通过药物敏感性试验筛选出部分对脓包分离株具有较好抑制作用的抗菌药物,但仅限于实验室层面,尚未进行临床验证,因此还需要后续工作来完善和补充。
参考文献
[1] 王晓平.一例兔皮下脓肿的诊治[J].现代农业科技,2012(13):292.
[2] 鲁杏华,何世成,谈志祥,等.猪化脓隐秘杆菌的分离与鉴定[J].中国畜牧兽医,2009(5):149-152.
[3] 陈飞,吴红艳,桓明辉,等.菌种11371 16S rRNA序列分析及鉴定[J].生物技术通报,2011(3):170-174.
[4] 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[K].北京:科学出版社,2001.
[5] 管庆松,袁雪波,项勋,等.引起犬脓皮病皮肤表层细菌分离鉴定[J].山东畜牧兽医,2013,34(1):20-21.
[6] SCHOUL L M,SCHOT C S,JACOBS J A.Horizontal transfer of segments of the 16S rRNA genes between species of the Streptococcus anginosus group[J].J Bacteriol,2003,185(24):7241-7246.
[7] 沈亚娟.应用16s rRNA基因序列分析鉴定非典型细菌的实验研究[D].重庆:重庆医科大学,2012.
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