单位文秘网 2021-08-13 09:10:12 点击: 次
信息提交GenBank数据库BLAST比对后,选择同源性较高的相关序列,由Clustal X序列比对软件进行多序列匹配,然后由Mega 4.0构建菌株JB4的16SrDNA系统进化树。
2.4 生长及脱氮曲线
将筛选得到的异养硝化-好氧反硝化菌株接种于LB液体培养基中前培养12 h(30 ℃,150 r/min),得到种子液。然后将种子液以5%的接种量分别接入装有100 mL初始氨氮浓度为65.45 mg/L的异养硝化培养基和初始硝态氮浓度为442 mg/L的好氧反硝化培养基中,于150r/min,30 ℃摇床培养,每隔4h取样测定OD600以及NO-3-N、NO-2-N、NH+4-N的浓度,计算脱氮率。并以吸光度为纵坐标,时间为横坐标,绘制菌株的生长及脱氮曲线。
2.5 分析方法
硝态氮的测定采用麝香草酚分光光度法[10];氨氮的测定采用纳氏试剂分光光度法;亚硝态氮的测定采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法[11];菌体生长量测定采用浊度法(OD600)。
3 结果和分析
3.1 异养硝化-好氧反硝化菌株的分离与鉴定
经多次分离纯化,筛选得到一株具有较高脱氮能力的异养硝化-好氧反硝化菌株,命名为JB4。
3.1.1 形态学鉴定
菌株JB4在LB培养基平板上28 ℃培养48 h后呈现的菌落特征为:圆形,白色,表面褶皱,有光泽,边缘呈波状,不透明。菌落直径为0.3~0.8 cm。菌株JB4革兰氏染色阳性,细胞呈直杆状、有芽孢,菌体大小为(0.57~0.95) μm×(1.71~3.8) μm,如图1所示。
3.1.2 生理生化特性
菌株JB4的生理生化特性为:兼性厌氧;可以在含有海藻糖、蔗糖、D-甘露糖、D-甘露醇、葡萄糖、D-核糖培养基上生长并产酸,不能在含有D-棉子糖、D-麦芽糖、乳糖、D-山梨醇、D-木糖培养基上生长并产酸;精氨酸双水解酶1阳性,精氨酸双水解酶2阴性;L-乳酸盐产碱阳性;酪氨酸芳胺酶、α-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶阳性。该菌株能在盐度为6.5%的培养液中生长。
3.1.3 16SrDNA序列测定与系统发育分析
提取并测定片段长度为1417bp的16SrDNA序列。此序列在NCBI数据库中进行同源性比较,结果显示菌株JB4和多株Bacillus sp.16SrDNA的相似性达99%以上,结合菌株的形态特征和生理生化特性,初步鉴定其为Bacillus sp.。选取同源性较高的序列用Mega 4.0软件,以Neighbor-joining法绘制系统进化树。
3.2 JB4生长曲线及脱氮性能
菌株JB4在30 ℃、150 r/min条件下摇床培养,每隔4h测定OD600及NO-3-N、NO-2-N、NH-4-N的浓度,计算脱氮率,结果如图2所示。菌株JB4在初始氨氮浓度为65.45 mg/L的异养硝化培养基中的生长降解曲线如图2(A)所示。由OD600的变化可知,菌株JB4在0~4 h是适应环境的延迟期,合成各种酶。4~12 h为对数期,16 h时菌株的OD600达到最大值为0.671,16~24 h为衰亡期。由氮的质量浓度变化可知,菌株JB4的硝化反应基本上是在延迟期和对数期完成,培养8 h后,氨氮质量浓度由65.45 mg/L降到31.81 mg/L,脱氮率达到51.40%,12 h后降到最低14.54 mg/L,脱氮率高达77.78%。但是从16 h开始氨氮质量浓度有回升趋势,上升到17.16 mg/L,这可能是因为16h达到了菌株生长的对数末期,菌体开始发生自溶,释放氨氮,菌株死亡释放的氨氮比菌株硝化的氨氮多。在整个硝化过程中没有亚硝态氮的积累,但是有少量硝态氮的积累,培养4h后便产生了14.96 mg/L的硝态氮,培养12 h后降至8.59 mg/L,之后几乎不再变化。相比于已报道的相关菌株[4,6](菌株X3经12 h培养,氨氮浓度从初始42降到18.17 mg/L,去除率为56.74%;菌株XF3经42h培养,可将73 mg/L氨氮几乎完全降解,但是亚硝态氮积累量达25.34 mg/L),菌株JB4具备氨氮去除速率高且不积累亚硝态氮的优势。该试验以氨氮为唯一氮源,并且在脱氮过程中只检测到氨氮和硝态氮,故认为培养基中总氮(TN)=总无机氮(TIN)=硝态氮+氨氮。由图2可知TIN的降解曲线与氨氮的降解曲线保持一致。这说明菌株JB4具备高效的硝化能力,且具有同步硝化反硝化的能力。
菌株JB4在初始硝态氮浓度为442 mg/L的好氧反硝化培养基中的生长曲线如图2(B)所示。由OD600变化可知,菌株JB4在0~4 h是延迟期, 4~12 h为对数期,16 h后OD600达到最大值0.642,20 h降至0.546,之后保持稳定,基本与在异养硝化培养基中的生长规律一致。由硝态氮的质量浓度变化可知,菌株JB4培养4h后的硝态氮由442 mg/L降至70.30 mg/L,脱氮率达到84.09%,12h后降到最低61.58 mg/L,脱氮率达到86.07%。反硝化过程的第一步是还原成亚硝态氮,然后再转变成N2O和N2。由刘俊女的研究[12]可知,亚硝态氮的累积与脱氮中间产物N2O的生成有正相关关系,而该实验中的亚硝态氮的累积量很小,最高也不超过1.83 mg/L,可以推测脱氮过程中N2是最主要的最终脱氮产物。与已报道的相关菌株X3和XF3相比[4,6](菌株X3经12h培养,硝态氮浓度从初始42 mg/L降到29.80 mg/L,去除率为29.05%,培养18h时硝态氮降至12.32 mg/L,去除率为70.67%;菌株XF3经48 h培养,硝态氮浓度可从初始84 mg/L降到9 mg/L,脱氮率高达89.3%,但是亚硝态氮积累量达到11.22 mg/L),菌株JB4硝态氮去除速率更高。此结果说明菌株JB4具备高效的好氧反硝化能力,且反硝化作用主要发生在菌株生长的对数期。
4 结论
(1)从福矛酒厂的堆积样中分离到一株异养硝化-好氧反硝化细菌JB4。JB4生长迅速、脱氮效果高,亚硝态氮积累量低于1.83 mg/L。
(2)经形态观察、生理生化特性鉴定及16SrDNA序列分析,将JB4鉴定为芽孢杆菌属细菌(Bacillus sp.)。
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