单位文秘网 2021-07-09 08:17:03 点击: 次
摘要:自然界中的木质素是潜在的丰富的可再生资源,近年来利用生物法降解木质素成为研究的热点。利用RT-PCR克隆了黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)木质素过氧化物酶基因(LiP)、锰过氧化物酶基因(MnP)、黑曲霉(Asperillus niger)葡萄糖氧化酶基因(gox)及白腐真菌(White Rot Fungi)漆酶基因(Lac),并构建了毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体,电转化入Pichia pastoris X-33宿主菌中,获得转化子并进行微培养,通过测定培养液的酶活,筛选出高酶活菌株。对4种重组菌株进行发酵,以经过处理的玉米皮作为底物,分别加入4种酶的发酵液及4种酶的混合液,于30 ℃反应后测定不同反应时间木质素的降解量,反应24h,木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、葡萄糖氧化物酶、漆酶吸光度D280nm的降低幅度分别为45%、39%、9%、57%;复合酶降解木质素的活性明显高于单一酶,吸光度的降低幅度为78%,说明木质素降解酶系的相互协同作用,提高了木质素的降解效率,为木质素酶解提供了新方法。
关键词:木质素;降解酶系;新方法;异源表达;毕赤酵母;酶活性
中图分类号: S188+.3文献标志码: A文章编号:1002-1302(2015)11-0058-05
收稿日期:2014-11-16
作者简介:刘金雷(1988—),男,河北邯郸人,硕士研究生,研究方向为分子定向进化与生物催化。E-mail:1060083086@qq.com。
通信作者:李天明,硕士,助理研究员,研究方向为分子定向进化与生物催化。E-mail:iamltm2000@hotmail.com。木质素是一种丰富的天然可再生的有机高分子化合物,广泛存在于植物体中,它包围着纤维素,和半纤维素一起填充于微原纤维之间,与纤维素、半纤维素一起构成植物细胞壁的主要成分,是自然界中植物光合作用制造的总量仅次于纤维素的碳素资源[1]。据估计,全世界每年由植物生长产生的木质素达1 500亿t,其中造纸工业废液中产生的工业木质素有3 000万t[2],因此对大自然给予人类的木质素等丰富的可再生天然资源予以充分重视并加以研究和利用,对于可持续发展具有重要意义。
木质素的结构复杂,不易分解[3-4],从20世纪开始,国内外的学者一直寻找木质素降解的最佳途径,研究内容主要包括物理法、化学法、物理化学法、生物降解法[5]。木质素的微生物降解不仅可以缓解环境污染、变废为宝,而且对生物质资源的充分利用有重大的现实意义,因此对木质素的生物降解已经成为当今世界国内外学者的研究热点[6-9]。木质素的降解是由一系列酶协同完成的,目前已知,在降解木质素过程中起主导作用的主要是漆酶(laccase,LAC)、木质素过氧化物酶(lignin peroxidase,LIP)、锰过氧化物酶(manganese peroxidase,MNP)这3种酶[10]。此外,葡萄糖氧化酶(glucose 1-oxidase,GO)、芳醇氧化酶(aryl-alcohol oxidase,AAO)、乙二醛氧化酶(gyoxaloxidase,GLOX)等也对木质素的降解产生一定的影响或者直接参与其降解[11]。
木质素降解的相关酶最早是在白腐真菌的胞外培养液中发现的,近年来随着国内外学者对木质素降解酶系的研究进展,发现在自然界中木质素的降解是由真菌、细菌、放线菌三者共同作用的结果,其中真菌起主要作用[12]。自然界中降解木质素能力最强的一类真菌是白腐菌[13-16],白腐菌虽然有广谱的酶系统,但是由于其生理代谢的特殊性以及近乎苛刻的对环境因子的要求,对于实现工业化产酶产生了严重阻碍。随着分子生物学的发展,基因工程菌的构建和木质素酶系的异源表达成为从根本上解决这一问题的一种可能的途径。本研究主要利用基因重组技术,利用毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达了不同来源的木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、漆酶基因,利用工程菌的发酵液降解天然木质素,并通过木质素降解酶系的协同作用,增强了木质素的降解效率,为木质素酶解提供了新方法。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1菌种和质粒大肠杆菌Trans 5α菌株购自北京全式金生物技术有限公司,P. pastoris X-33菌株和表达质粒pGAPZαA由河北科技大学分子生物学实验室保存,黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、黑曲霉(Asperillus niger)、白腐真菌(White Rot Fungi)为笔者所在实验室保藏的野生型菌株。
1.1.2培养基LB、YPDS、YPD培养基均按照《Invitrogen公司操作手册》推荐的方法配制。
1.1.3试剂限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、BcabestTM RNA PCR试剂盒,购自宝生物工程(大连)有限公司(TaRaKa);Trizol Reagent,购自Gibco公司;DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒、琼脂糖,购自天根生化科技(北京)有限公司;PMD-18克隆载体,购自北京全式金生物技术有限公司;PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成;DNA测序由宝生物工程(大连)有限公司完成。如无特别说明,所有的化学试剂均为分析纯产品。
1.2试验方法
1.2.1基因的操作质粒提取、酶切反应、DNA片段回收、连接以及大肠杆菌转化等均参照试剂盒提供的方法进行操作。
1.2.2基因的克隆采用液氮研磨-SDS法提取黄孢原毛平革菌、黑曲霉和白腐真菌总RNA,以合成的cDNA第1链为模板进行PCR扩增,PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测,纯化PCR产物,与PMD-18连接,构建PMD-18-LiP、PMD-18-MnP、PMD-18-gox、PMD-18-Lac质粒,转化E.coli Trans5α感受态细胞,涂布于含150 μg/L 氨苄青霉素、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、X-gal的LB平板,37 ℃培养过夜。挑取白色菌落,提质粒,PCR验证,对阳性克隆进行DNA序列测定。
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