单位文秘网 2021-07-08 08:16:22 点击: 次
摘要:分析一对细胞或组织在不同状态下基因表达的差异,已成为分子生物学研究领域的热点之一,用于识别差异表达基因的方法有多种,DDRT-PCR 是近年来较为广泛应用的一种技术。DDRT-PCR 技术有很多优点,但同时也存在不少问题,通过对其进行不断地改进使这项技术在分子生物学中能更好更广地应用。
关键词:mRNA;差异显示;PCR
中图分类号:Q343 文献标识码:B 文章编号:1007-273X(2013)04-0068-03
高等生物的细胞中约有1.5万个基因处于表达状态,但只有15%的基因得以表达。基因的差异表达不仅是细胞形态和功能多样性的根本原因,同时也是各种生理及病变过程的物质基础。比较不同细胞间或同一细胞不同时间与空间基因表达的差异,分析与病理变化相关的特异性表达基因,对生物学及相关学科的研究有重要意义[1]。
20世纪90年代初,Bauer等[2]在AP-PCR 和RT-PCR 技术的基础上建立了mRNA 差异显示或称差异显示逆转录PCR(Differential Display reverse transcription PCR,DDRT-PCR),是一种有效的筛选差异表达基因的方法。1994年Erric Haay等将这种方法正式命名为差异显示反转录聚合酶链式反应(DDRT-PCR)。与研究DNA 差异相比,研究mRNA 的差异排除了非编码区的影响,使研究范围缩小到表达基因水平上,为人类进一步了解生命过程提供了一个工具。
1 mRNA 差异显示技术的原理及技术路线
mRNA 差异显示技术是在转录水平上对基因表达进行分析的。成熟的mRNA的 3′端具有poly(A)尾巴,以一系列Olige(dT) 12MN 引物中的一种(M、N分别代表A、C、T、G四种碱基中的一种,M 不能为T)锚定于两种或两种以上一条mRNA,再于变性PAGE胶上分离目的片段,并就基因表达的差异对比材料的mRNA的poly(A)尾部。在反转录酶的作用下,逆转录真核细胞中全部表达的mRNA,可获得1/12 cDNA,同时5′端设计一组随机引物,通过PCR 扩增,进行比较。将有差异的基因片段从凝胶上切割下来,用相同的锚定引物和随机引物对分离的片段进行二次扩增,得到差异片段后将该片段克隆、测序,并同基因库的序列进行同源性比较或者将差异显示的DNA 克隆测序后作为探针,进行斑点杂交和Northern 印迹确保是否是真阳性结果,以进一步分析其功能。
2 实验材料的选择
在细胞或组织选择方面应尽可能使相互比较的样本在基因型上一致或比较接近, 以减少非相关带的检测。对于培养的细胞而言, 互相比较的细胞应在相同的培养基中培养。高质量的RNA是DDRT-PCR 技术成功的关键因素之一。另外, 在进行DDRT-PCR实验时, 所有的PCR 反应最好都应用同一来源的Taq DNA 聚合酶,因为不同来源的Taq DNA 聚合酶的贮存缓冲液及其在贮存和反应温度下的活力可能会存在差异, 从而可能会导致DNA 带型的差异。
3 mRNA 差异显示技术的优点及缺陷
DDRT-PCR 技术通过对一系列引物的组合利用,能够在较短的时间内获得差异显示基因,该方法具有很多优点,如敏感(可鉴定低丰度的mRNA)、快速、易操作等。然而在实际操作中仍存在一些问题,主要表现为假阳性率高、对高丰度mRNA 具有明显的倾向性[3]、易引起污染(因为起初的mRNA 差异显示技术是通过同位素进行放射自显影显示差异条带的图像的),此外由于某些序列的特异性,一些差异表达的转录不能得到分离[4], 所以凝胶中的单条带可能由1 种以cDNA 片段所构成。
4 mRNA 差异显示技术的改进
针对mRNA差异显示技术存在的问题,人们想到很多新方法来完善这项技术。
4.1 引物的改进
最初的锚定引物为Oligo dT12MN(M=A/C/G; N =A/T/C/G),共12种组合,其工作量很大。Liang等[5]将锚定引物先后改为4种兼并引物(T12MA、T12MT、T12MC、T12MG。M=A/C/G)和单碱基锚定引物T11M (M=A/C/G),减少了工作量,增加了重复性,也提高了分辨率。又将cDNA 分组的数量减少到3 个[6],并证明使用3 个单碱基锚定Oligo(dT) 引物可以解决与使用双核苷酸丰余引物相关的大部分问题。随后也有人用较长的引物,使问题得到进一步改善[7]。
4.2 PCR的改进
Marten 等建议两步PCR 法,即开始的4个循环为低严谨性,后面则采用高严谨的PCR 循环,他将此技术称为EDD(Enhanced diffferential display)。推荐的PCR 参数为:开始3 个低严谨循环:第一个循环,94 ℃变性5 min,40 ℃退火5 min,68 ℃延伸 5 min;接着两个循环:94 ℃变性2 min,40 ℃退火5 min,68 ℃ 延伸5 min;后面的22~25个为高严谨的循环: 94℃变性1 min, 60 ℃退火1 min, 68 ℃延伸2 min, 然后68 ℃延伸7 min。经过改进,不仅保持差异带的特征性,而且显著地增强了重复性和敏感性。
4.3 提高低拷贝mRNA 的差异显示率
DDRT-PCR 对高拷贝mRNA 有很强的倾向性。在DDRT-PCR 中模板极多,几乎所有模板的启动均有引物错配,而且dNTPS的浓度极低,因而造成竞争机制,使DDRT-PCR 产物更倾向于高拷贝mRNA ,而对低拷贝检测较差。cDNA 末端快速扩增法(RACE) 的成功应用解决了这一问题,能从微量mRNA和低丰度转录本中克隆全长cDNA,利用这项技术有效地解决了DDRT-PCR中的这一难题[8]。
4.4 应用非放射性同位素
起初mRNA 差异显示是通过放射性同位素进行放射自显影显示差异条带的图像,但这种方法易造成污染环境, 对人体有害,并且费时费力。为克服这个缺点,采用了非同位素mRNA 差异显示,现在这项技术发展很快[9]。有研究者采用荧光素代替同位素对PCR 产物进行标记, 电泳分离后的产物可在DNA 测序仪上读取,既改善了操作的安全性, 也提高了敏感性和差异显示的分辨率[10]。
4.5 电泳的改进
非变性凝胶电泳用在差显技术上,降低了显示谱带的复杂性,同时简化了后期进行克隆筛选的工作。George等[11]用毛细管电泳系统对荧光标记的表达序列标签进行快速自动化识别, 而且该电泳系统经改造后可用于cDNA 带的收集。
4. 6 应用反向Northern 印迹杂交
为了排除假阳性的干扰,可以采用反向Northern 印迹杂交来验证[12,13]。反向Northern 印迹杂交是一种比较节省、快速的方法[14],可以在一次试验中检测出将全部待测的片段。李子银等[15]通过制备两个cDNA 探针进行两轮反Northen 杂交结合质粒酶切图谱分析,建立一种快速筛选差异阳性cDNA 的方法,获得的阳性克隆cDNA 可以用作探针获取全长序列。
5 展望
mRNA差异显示技术在逐渐完善,因其具有操作简便、快速,一次能分析多个样品等优点而给研究带来了诸多便利, 在多种基因检测技术中,mRNA 差异显示技术作为研究细胞、组织在不同条件下基因表达水平差异的重要手段,不仅应用于生物医学[16,17]也广泛应用于动物遗传育种[18-21]、动物营养[22]等领域。经过不断地改进和完善,它已经成为生物医学以及农业技术的一个很好的研究工具。
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