单位文秘网 2021-07-09 08:16:58 点击: 次
摘要:为获得转化底物植物甾醇为9-羟基-雄烯二酮(简称9-OH-AD)的高产稳定菌株,将出发菌株分枝杆菌制备成原生质体,并对其原生质体进行定向紫外诱变筛选。结果表明,NaCl为最佳的分枝杆菌原生质体渗透稳定剂,最适浓度为0.5 mol/L,在此条件下获得的原生质体数量为3.1×108个/mL,且最终获得1株比出发菌株9-OH-AD生产量提高84.7%的菌株MS23,经传代3次,9-OH-AD的积累量分别为37.32、41.64、38.77 mg/L,具有良好的遗传稳定性。产品通过液相色谱进行确证,同时在5 L发酵罐中进行转化制备9-OH-AD的初步研究。经原生质体紫外诱变获得的遗传性稳定的9-OH-AD高产菌株可用于进一步的转化制备条件优化研究。
关键词:分枝杆菌;原生质体诱变;9-OH-AD;菌种选育;液相色谱
中图分类号: S182文献标志码: A文章编号:1002-1302(2017)23-0288-04
收稿日期:2016-09-16
国内外以甾醇为原料、利用分枝杆菌等微生物转化生产9-OH-AD已成为研究热点。例如Shtratnikova等已测出能够转化植物甾醇为9-OH-AD的分枝杆菌VKM Ac-1817D的完整基因序列[4];姚抗深入研究了微生物降解甾醇中与 9-OH-AD的合成和降解相关的2个关键酶(3-甾酮-9α-羟基化酶与3-甾酮-Δ1-脱氢酶)[5];袁家代等通过构建kshA和kshB基因共表达的重组菌对3-甾酮-9α-羟基化酶编码基因进行异源表达,成功对分枝杆菌生物转化特性进行了改造,制备获得了9-OH-AD[6];范书玥等从土壤中筛选出具备甾醇降解能力的分枝杆菌(Mycobacterium sp. NwIB-01),对该菌的3-甾酮-9α-羟基化酶进行了基因克隆、异源表达与分离纯化,为进一步利用基因工程手段改造分枝杆菌菌株,提高其转化甾醇的能力从而为利用基因工程菌进行工业化生产9-OH-AD等奠定了基础[7-8]。此外,Sukhodolskaya等研究表明,主产9-OH-AD的同时由于残余的3-甾酮-Δ1-脱氢酶的存在,也会有部分的降解发生[9]。因此,田琳等通过同源重组用体外突变失活的3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因代替分枝杆菌染色体上正常的3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因,导致整个3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因失活,以让3-甾酮-Δ1-脱氢酶无法表达,从而使9-OH-AD得以积累[10]。另一方面,9-OH-AD的生产存在甾醇水溶性差、传质效率低、底物毒害、产物抑制以及产物降解等问题,许多研究者也做了大量相关的研究[11-14]。总体而言,国内外尚无生物法制备9-OH-AD的工业生产,筛选并获得制备9-OH-AD的高效菌株具有重要的工业意义。
为此,本研究对实验室已有的分枝杆菌进行原生质体紫外诱变系统研究,确定分枝杆菌原生质体的制备条件,并比较筛选得到的菌株制备生产9-OH-AD的能力,获得1株生产转化能力较好的菌株,最后用该菌株在5-L生物反应器中进行转化制备9-OH-AD的初步研究。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试验菌株出发菌株分枝杆菌(Mycobacterium sp.)于笔者所在实验室4 ℃冰箱中斜面保藏。
1.1.2试剂植物甾醇,由浙江省神洲药业有限公司提供;玉米浆,购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;溶菌酶,购自国药集团化学试剂有限公司;酵母粉为生化试剂;甘油、K2HPO4、MgSO4·7H2O、NH4Cl、NaNO3、(NH4)2HPO4、无水乙醇、Na2HPO4、NaH2PO4、乙二胺四乙酸(EDTA)、NaCl、KCl、MgSO4、蔗糖、甘露醇、乙酸乙酯等试剂均为分析纯。
预处理液:0.8% EDTA、0.1%巯基乙醇,用pH值为6.0的磷酸缓冲液配制。
原生质体渗透稳定剂:0.5 mol/L蔗糖、10.0 mmol/L MgCl2,用pH值为6.0的磷酸缓冲液溶解。
分枝杆菌去壁酶液:含质量分数为1%的溶菌酶的原生質体渗透稳定剂,微孔滤膜过滤除菌。
1.1.3仪器SPX-250BSH-II生化培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司);高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司);BIOTECH-5JG-7000A 5 L发酵罐(上海保兴生物设备工程有限公司);PHS-3TC pH电极(上海天达仪器有限公司);YXQ-LS-50SⅡ立式压力蒸汽灭菌器灭菌锅(上海博迅实业有限公司);TS2102摇床(上海天呈实验仪器制造有限公司);SW-CJ-2FD超净工作台(上海博迅实业有限公司);SA224S电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]、TGL-20M离心机(上海卢湘离心机仪器有限公司)。
1.1.4培养基固体/斜面培养基:酵母粉5.0 g/L、甘油10.0 g/L、磷酸氢二钾0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、氯化铵1.0 g/L、琼脂20.0 g/L,pH值为7.4。
种子培养基:葡萄糖6.0 g/L、甘油2.0 g/L、硝酸钠 5.4 g/L,磷酸氢二铵0.6 g/L,酵母粉 15.0 g/L,pH值为 7.5~8.0。
发酵培养基:玉米浆20.0 g/L,硝酸钠5.4 g/L,磷酸氢二铵0.6 g/L,无水乙醇10.0 mL/L,植物甾醇5.0 g/L,pH值为8.0~8.5。
再生高渗培养基:酵母粉5.0 g/L,甘油10.0 g/L,磷酸氢二钾0.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,氯化铵1.0 g/L,蔗糖 0.8 mol/L,琼脂20.0 g/L,pH值为7.4。
1.2试验方法
1.2.1原生质体渗透稳定剂的选择分别配制NaCl、KCl、MgSO4、蔗糖、甘露醇浓度为0.7 mol/L的再生高渗培养基,将诱变菌株分别涂于各再生高渗培养基上,每个处理3个平行,于30 ℃恒温生化培养箱中培养7 d后,根据高渗培养基中原生质体的制备数确定最佳原生质体渗透稳定剂。
1.2.2原生质体渗透稳定剂NaCl浓度的确定配制NaCl浓度分别为0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mol/L的再生高渗培养基,将诱变菌株分别涂于各浓度再生高渗培养基上,每个浓度3个平行,于30 ℃恒温生化培养箱中培养7 d后,根据各高渗培养基中原生质体的制备数确定最适NaCl浓度。
1.2.3细胞悬液制备及原生质体的制备与再生用接种环在斜面培养基上刮取1环菌体,接种于种子培养基上,于 30 ℃、200 r/min摇床上振荡培养48 h后,取 10 mL 种子液,4 000 r/min 离心10 min,用渗透压稳定剂洗涤2次,将菌体悬浮于10 mL渗透压稳定剂中制备成细胞悬液。取1 mL细胞悬液稀释至10-6,用平板菌落计数法测细胞悬液浓度。原生质体诱变参考相关文献[15]并加以改进。取5 mL细胞悬液,4 000 r/min 离心10 min,弃上清液,加入5 mL预处理液,静置15 min,用渗透压稳定剂洗涤2 次,离心10 min弃上清液,然后加入5 mL 1%溶菌酶液,30 ℃振荡保温2 h,2 000 r/min 离心10 min后,加入5 mL渗透稳定剂悬浮原生质体。取 0.5 mL 原生质体悬液,加入4.5 mL渗透稳定剂稀释至10-6,涂布于再生高渗培养基培养计数。另取0.5 mL原生质体悬液,加入4.5 mL无菌水,稀释至10-6后,用固体培养基培养计数。
1.2.4紫外诱变将制备好的原生质体用渗透压稳定剂稀释至10-6,取0.2 mL涂布于再生高渗培养基表面,置于已预热30 min 20 W紫外灯下,照射距离为30 cm。磁力搅拌下分别照射20、40、60、80、100、120、140、160、180 s,每个时间3个平行,30 ℃下倒置遮光培养1周。观察菌落形态,统计平板中的菌落数量,计算致死率,以未经诱变处理的菌悬液涂布平板作对照。
1.2.5固体斜面培养将菌株活化扩培于30 ℃恒温生化培养箱中培养3~4 d,紫外诱变再生渗透培养基中菌株生长培养7 d。
1.2.6摇瓶转化试验挑取1环菌种接种于装发酵培养基50 mL的250 mL摇瓶中进行种子液培养,在30 ℃、200 r/min摇床上培养3 d后,取5 mL种子液接入装有0.25 g甾醇的 50 mL 发酵液中,于30 ℃、200 r/min摇瓶中培养转化植物甾醇制备9-OH-AD,培养时间为120 h。
1.2.75-L发酵罐转化试验将活化培养3 d的种子液按10%接种量接至装有12.5 g甾醇的2.5 L发酵培养基中,于30 ℃、400 r/min培养,pH值维持在8.2~8.7。每隔12 h取1次样,测样品中9-OH-AD的浓度。
1.2.8高效液相色谱(HPLC)分析方法转化120 h后,按体积比1 ∶1加入乙酸乙酯,于30 ℃、200 r/min提取30 min后,4 000 r/min 离心10 min,取乙酸乙酯有机相层,用 0.22 μm 有机膜过滤后超声脱气进行高效液相色谱测定。色谱条件:二极管阵列检测器(DAD检测器),波长254 nm;色谱柱为Thermo:ODS-2 HYPERSIL(5 μm×250 mm×4.6 mm);柱温40 ℃;流动相 ∶甲醇与水体积比为 7 ∶3,流速1 mL/min,进样量为30 μL。
2结果与分析
2.1原生质体渗透稳定剂的选择
在再生高渗培养基配制中分别选用5种浓度为 0.7 mol/L 的渗透压稳定剂,考察这些稳定剂对分枝杆菌原生质体制备的影响。由图1可知,以KCl和蔗糖作为原生质体渗透压稳定剂对原生质体制备效果的影响较小,而以NaCl作为渗透稳定剂的再生高渗培养基中所制备的原生质体数量较其他4种高,达到5.85×108 个/mL。其原因主要在于NaCl可能更符合菌体的外界液体环境,菌体外围的Na+与菌体的滲透压有关,能够更好地维持菌体的渗透压使原生质体不被外界破坏且能促进细胞壁的生成,从而获得较多的原生质体。因此,本研究选用NaCl作为分枝杆菌原生质体的渗透压稳定剂来进行原生质体的制备。
2.2原生质体渗透稳定剂NaCl浓度的确定
在再生高渗培养基中加入不同浓度的NaCl溶液,考察其对分枝杆菌原生质体数量的影响。由图2可知,当NaCl浓度为0.5 mol/L时原生质体个数达到最大值,为3.1×108个/mL。随着NaCl浓度的进一步增大,原生质体的数量逐渐减少,原因可能是NaCl浓度为0.5 mol/L时使原生质体的渗透压恰好与外界液体环境平衡,这个浓度能够维持细胞稳定并促进细胞壁的生成,随着NaCl浓度的增大,外界液体环境的渗透压易使原生质体脱水死亡从而导致原生质体制备率降低。
2.3原生质体制备率和再生率
由表1可知,通过公式原生质体制备率=(酶解前菌落数-固体培养基上菌落数)/酶解前菌落数×100%,原生质体再生率=(再生高渗固体培养基上菌落数-固体培养基上菌落数)/(酶解前菌落数-固体培养基上菌落数)×100%计算得原生质体的制备率和再生率分别为98.3%、52.6%。表明以0.5 mol/L NaCl作为渗透压稳定剂,分枝杆菌原生质体在经紫外诱变后可获得较高的原生质体制备率和再生率。
2.4菌株生长曲线及诱变条件确定
2.4.1分枝杆菌生长曲线将分枝杆菌用接种环接于装有 50 mL 种子液的250 mL摇瓶中,于30 ℃、200 r/min摇床中培养,每隔6 h测定菌液600 nm处的吸光度。由图3可知,分枝杆菌在0~48 h时处于停滞期,在48~96 h期间为对数期,96 h之后步入平稳期。48~96 h的对数期是分枝杆菌生长代谢最旺盛的时期,也是分枝杆菌对外界环境最敏感的时期,在此时间段对其进行诱变处理易获得理想突变株。
2.4.2紫外诱变对菌株的致死率由图4可知,致死率随紫外照射时间的延长而增加,140 s左右达到99%,之后基本稳定。当紫外照射时间为60~74 s時,致死率为70%~80%,此时回复突变株的出现率较低,因此确定紫外诱变的最佳时间为65 s。
2.5突变菌株摇瓶转化制备9-OH-AD分析
经过紫外诱变筛选获得了143株突变株,挑取其中的63株进行初筛,经过初筛后获得11株转化积累9-OH-AD效果优于出发菌株的突变株。由表2可知,菌株MS5的 9-OH-AD积累量为 62.31 mg/L,与出发菌株相比,提高了134.25%。11株菌株中,MS13菌株的9-OH-AD积累量最低,但与出发菌株相比提高了32.89%。对11株菌株进行复筛和遗传稳定性研究,各菌株传代3次产9-OH-AD的结果如图5所示,MS23菌株经过3次连续传代,其9-OH-AD积累量基本保持稳定,3次传代后其9-OH-AD产量分别为37.32、41.64、38.77 mg/L,表明该菌株相对来说具有良好的遗传稳定性。采用HPLC对所得到的发酵液样品进行液相色谱分析。由图6可知,出发菌株、突变菌株、9-OH-AD标准品均在3.03 min出现吸收峰,说明所获得的样品在这一时间点出现的吸收峰即为9-OH-AD的峰,所获得的MS23突变菌株转化制备获得的对应产物为9-OH-AD。
表2出发菌株及突变株摇瓶培养转化制备9-OH-AD的情况
菌株9-OH-AD积累量(mg/L)出发菌株26.60MS237.88MS338.14MS562.31MS1135.46MS1335.35MS1942.25MS2349.13MS2746.16MS2835.57MS3039.92MS5258.22
2.65 L发酵罐中高产菌株MS23转化制备9-OH-AD分析
考察菌株MS23在5 L发酵罐中转化底物甾醇为9-OH-AD的情况。由图7可知,在0~102 h,9-OH-AD的产量增加不明显,而到102 h时,9-OH-AD的产量进入对数期式的增长,在124 h时达到50.41 mg/L,可能是由于在菌体转化底物植物甾醇代谢途径中产生了能够促进3-甾酮-9α- 羟基化酶活性的代谢物, 使得9-OH-AD的合成进程
加速从而导致9-OH-AD积累量的对数式增长[16]。124 h之后9-OH-AD的产量逐渐减少,由124 h时的50.41 mg/L在143 h时降为48.66 mg/L,可能由于C1,2位脱氢酶的作用效果在124 h后开始大于3-甾酮-9α-羟基化酶,使得9-OH-AD的母核得以降解从而进一步水解导致9-OH-AD的产量减少[17-18]。总之,发酵罐中生物转化制备9-OH-AD,其积累量与摇瓶转化相比提高了2.61%,今后将进一步通过控制发酵罐中转速、温度、pH值及添加甾醇底物的促溶剂等其他发酵条件来提高9-OH-AD的产量。
3结论与讨论
原生质体诱变是通过去除菌体细胞壁以便更好地进行诱变的一种诱变方法,可使紫外线作用更为直接,可增强诱变效果。姚笛等对1株产木糖醇季也蒙的毕赤酵母进行原生质体紫外诱变,获得的木糖醇产量明显提高,比出发菌株DQ11提高了186%,且具有良好的遗传稳定性[19]。胡基华等对1株产几丁质酶的黏质沙雷氏菌进行原生质体紫外诱变,获得比原始菌株提高4.3倍的几丁质酶产量[20]。本研究通过原生质体诱变试验表明,NaCl为最佳的分枝杆菌原生质体渗透稳定剂,其最适浓度为0.5 mol/L。在此条件下制备的原生质体通过紫外诱变,在摇瓶生物转化中,获得的高产稳定菌株MS23比出发菌株转化制备9-OH-AD的能力提高了847%。通过初步的发酵罐放大转化,9-OH-AD积累量达到50.41 mg/L。张怀成等研究的分枝杆菌转化甾醇产 9α-羟基雄甾烯酮促进剂的筛选中,通过加入促进剂聚醚改性硅油投入10 g/L底物,获得的9-OH-AD大于 4 g/L[11]。高兴强等研究的油水乳化体系中分枝杆菌转化植物甾醇产 9α-羟基雄甾烯酮中,投入20 g/L底物获得1.28 g/L 9-OH-AD[12]。因此,虽然相对于出发菌株来说MS23菌株转化植物甾醇制备9-OH-AD的能力有所提高,但 9-OH-AD 的积累量还是相对较低,还不能满足工业化生产的要求。进一步的研究将对转化过程的工艺进行系统优化,以期获得更高的9-OH-AD制备率。
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