单位文秘网 2021-07-10 08:15:51 点击: 次
摘要 来源于链霉菌属噬菌体(streptomyces phage)的phiC31定点重组酶系统可诱导重组位点attB(细菌基因组)和attP(噬菌体)之间DNA序列的重组,该重组酶是继Cre/lox重组酶系统和FLP/frt重组酶系统之后的又一种新型位点重组酶系统,在原核和真核生物基因整合、删除和倒位等方面得到广泛应用。文中主要对phiC31重组酶系统的来源、结构特性以及在植物转基因中的应用研究进展进行综述,为phiC31定点重组酶的进一步开发利用提供依据。
关键词 phiC31重组酶系统;基因整合;基因删除;基因倒位
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2014)05-01298-04
Abstract phiC31 sitespecific recombination system that derived from Streptomyces phage can mediate recombination of the DNA sequences between the recognition sites of attB site (from bacterial genome) and attP site (from phage), which is one of new type sitespecific recombinant system discovered after Cre/lox recombinant system and FLP/frt reorganization system, which has been widely used in gene integration, gene elimination and DNA inversion in prokaryotic and eukaryotic organism. This review described the origin, structural characteristics of the phiC31 sitespecific recombinant system and its applications in plant transgenic research.
Key words phiC31 sitespecific recombination system; Gene integration; Gene elimination; Gene inversion
位点特异重组酶系统(site-specific recombination system)是由单个多肽酶识别特定的DNA序列而发生重组的遗传操作系统。整个系统主要由2个部分构成:重组酶和特异性识别位点。重组酶仅能催化特异性位点间的重组,不能催化其他任何2条同源或非同源序列之间的重组,重组具有高度的特异性和保守性。在生物体内或者离体细胞中,位点重组酶均能诱导特定识别位点之间的基因序列发生高效、精确的重组反应,获得稳定的重组产物[1]。根据重组酶特异识别位点在染色体上的位置以及两个识别序列的排列方向,重组发生后可产生以下3种结果:①当重组识别位点位于不同的染色体上时,重组导致2条染色体发生易位、交换;②当重组识别位点位于同一染色体上且排列方向一致时,识别位点之间的DNA序列被删除;③当重组识别位点位于同一染色体上且排列方向相反时,重组后导致识别位点间DNA序列发生倒位[2](图1)。目前,来自Pl噬菌体Cre/lox [3]、酵母2μ质粒FLP/frt[4]和链霉菌属噬菌体phiC31[5]等重组酶系统的重组功能已在原核生物、动物、植物等多种生物体中得到了验证。
根据重组酶氨基酸的同源性以及催化产物的生化特性,重组酶分为酪氨酸重组酶(tyrosine recombinase)和丝氨酸重组酶(serine recombinase)2大类。其中,酪氨酸重组酶又称为“λ重组酶”家族,在酪氨酸重组酶的催化结构域中,都有一个保守的酪氨酸残基负责攻击核苷酸骨架结构,出现单链断裂切口,产生5-OH末端和3-磷酸基-络氨酸的切割中间体,类似于同源重组中产生的Holliday模型[6]。Cre/lox和FLP/frt重组酶系统是该家族中具有代表性的2个成员。丝氨酸重组酶具有更为保守的催化结构域,其近N端为活性区域,包含一个丝氨酸,该丝氨酸残基攻击DNA骨架使其交错切割,形成3-OH的双链断裂末端,而5-磷酸基与重组酶共价键连接形成联会中间体,随后发生翻转再重新连接,该重组过程类似于双链断裂重组模型(double-stand breakage)[7]。文中主要介绍的phiC31重组系统即是来源于该类家族中分子量较大的大型丝氨酸重组酶的亚家族[8]。
1 噬菌体phiC31重组酶重组特点
噬菌体phiC31重组酶由613个氨基酸构成,能够识别来自噬菌体自身的attP(39 bp)位点和来自细菌基因组的attB(34 bp)位点。attP和attB识别位点均具有7 bp的核心序列(crossover site)及位于其核心序列两侧7 bp的反向重复序列(inverted repeats)(attP中称C、C′,attB中称B、B′)。其中的attP位点还包含臂型结合位点(arm-type sites,分别为P1、P2、P′1、P′2和P′3)。重组过程中,上述结合位点均参与phiC31重组酶的结合。此外,还包括3个宿主因子(Integration host factor,IHF;分别为H1、H2和H′)、3个解离酶(excisionase, Xis)结合位点以及1个辅助因子(factor for invertion stimulation, Fis)结合位点[9]。上述复杂的phiC31重组酶识别序列组成,保证了phiC31重组酶介导重组反应的精确进行。在Cre/lox系统和FLP/frt系统中,重组酶识别位点除了核心序列(8 bp)和两侧完全对称的反向重复序列外,没有其他任何辅助因子的结合位点,且重组反应发生前后识别位点基因序列不会发生改变,由于生物体内时刻进行着分子间的相互作用,在相应重组酶存在的条件下,重组反应会向着删除和整合2个方向同时进行,即Cre/lox系统和FLP/frt系统所诱导的重组反应是可逆的。通过对Cre/lox系统中识别位点的改造,Albert等设计了缩短的loxP位点,有效降低了逆向重组反应的进行,但同时其正向重组效率也被大大降低[10]。而phiC31重组酶体系,不仅对酶底物DNA的核心序列同源性要求十分严格,且识别位点attP与attB自身即为结构具有差异的结合位点,重组发生后产生phiC31重组酶不能识别的attR和attL序列,从而严格控制重组反应的单方向进行[11]。
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