单位文秘网 2021-07-09 08:16:42 点击: 次
[摘要] 通过对新疆紫草Arnebia euchroma红白2种色系悬浮细胞的表型、生长曲线、次生代谢产物积累研究,用数学建模模拟新疆悬浮细胞的增殖和紫草素类化合物积累情况,研究新疆紫草悬浮细胞生长和次生代谢生产的动力学参数,发现红色高产系为针对紫草素类次生代谢产物生产的优良细胞株系,白色低产系可能为突变株系。用Logistic模型对生长函数进行拟合并求导数,得到新疆紫草悬浮细胞的生长速率及生长加速度变化曲线,确定了新疆紫草悬浮细胞继代培养最佳时期为继代到新鲜培养基中的第15天,给诱导处理的最佳时期为继代到新鲜培养基中后第13~14天。并且通过比较新疆紫草红色系细胞增长速率的变化趋势与紫草素类化合物积累曲线发现,新疆紫草悬浮7细胞红色系生物量快速增长时不利于紫草素的合成与积累。
[关键词] 新疆紫草悬浮培养;生长曲线;数学建模;紫草素;Logistic模型;动力学
[稿件编号] 20121203015
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81130070, 81072989);国家中医药管理局行业科研专项(201107009,201207002);国家科技支撑计划项目(2012BAI29B02)
[通信作者] *郭兰萍,Tel: ( 010) 64011944,E-mail: glp01@126.com
[作者简介] 王升,硕士研究生,E-mail: mmcniu@163.com
新疆紫草Arnebia euchroma (Royle) Johnst是传统中药材紫草Arnebiae Radix的重要来源。其主要成分为紫草素、去氧紫草素、乙酰紫草素等萘醌类化合物以及紫草多糖[1-2],具有抑制DNA拓扑异构酶[3]、抗肿瘤[4]和免疫调节等多种药理作用[5-6]。此外,紫草素类化合物作为重要的天然化妆品原料、食品添加剂和印染化工原料,被誉为“天然红色素之王”,具有很高的经济价值。新疆紫草野生资源分布狭窄、数量稀少,近年的过度采集和生态环境的破坏致其野生种类分布区域和数量迅速减少[7],为了应对这一资源问题,国内外学者利用植物细胞培养技术在提高紫草素类化合物的产量,对紫草素及其衍生物生物合成途径和调控进行了大量的研究。
本文以新疆紫草悬浮细胞红色系和白色系为材料,研究这2种悬浮细胞的生长特性及次生代谢产物的积累情况,并对细胞生长动力学做初步研究,为更好的进行紫草素及其衍生物生物合成及其调控的研究,提高新疆紫草细胞中紫草素类次生代谢产物的产量,实现大规模生产紫草素等次生代谢产物打下基础。
1 材料
新疆紫草愈伤细胞红色系和白色系取自中国科学院植物研究所叶和春研究员处。人工培养箱(Conviron Adaptis CMP6010);摇床(TCYQ超大型摇床);冰箱(Haier BCD-290W);电子精密天平(Sartorius BS 2202S);超净工作台(SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台);全自动高压灭菌锅(TOMY SS-325);电热干燥箱(上海-恒科仪器有限公司,DHG-9145AZ);微波炉(格兰仕);分析型酸度计(JENWAY 3510);紫外分光光度计(北京普析);荧光显微镜(Olympus-BX51);其他常规组培设备。色谱纯甲醇为Fisher Chemical 公司产品。其他试剂如异戊醇、乙酸均为分析纯,以及培养基母液配制所需固体无机试剂均为国药集团化学试剂有限公司产品。
2 方法
2.1 愈伤组织的培养 诱导出的愈伤组织接种于含50 mL改良LS固体培养基的500 mL广口瓶中,置于25 ℃培养箱中避光培养,每22~25 d继代1次。
2.2 细胞悬浮培养体系的建立 将生长旺盛、结构疏松、易于分散的愈伤组织转入改良LS液体培养基中,置于摇床上进行悬浮培养,摇床转速120 r·min-1,培养温度25 ℃,暗培养。3~5次继代培养后可获得性状良好的悬浮细胞系。每次继代接种量为3 g,于30 mL改良LS液体培养基的100 mL三角瓶中,作为实验材料,培养条件同上。
2.3 细胞增殖(鲜重、干重)测定 分别将生长0,5,10,13,15,17,20 d的新疆紫草红悬浮细胞红色系和白色系取出,每个时间点分别取红色系和白色系各3瓶,真空抽滤。将滤纸上的细胞转移至干净的平皿中称重,平皿于40 ℃鼓风烘箱烘24 h至恒重后称取干重。用量筒测量每瓶细胞过滤后的滤液体积,并取2 mL置于-20 ℃冰箱中保存待测紫草素类化合物含量。
2.4 悬浮细胞中紫草素类代谢产物的提取及检测 参照药典,用左旋紫草素标定总萘醌的方法,测定新疆紫草细胞中紫草素类化合物的含量。称取约取0.02 g新疆紫草干细胞,球磨仪研磨后加入1.5 mL甲醇,25 ℃超声60 min,离心,去上清液于520 nm处进行紫外检测。标准曲线依据不同浓度左旋紫草素标准溶液在520 nm处的吸光度绘制[8]。
2.5 悬浮培养基中紫草素类化合物的提取及检测 取1 mL悬浮细胞培养基或者用左旋紫草素配制不同浓度的标准溶液,加入500 μL异戊醇,振摇5 min,静置10 min至分层,12 000 r·min-1室温离心2 min,取200 μL上面油层加入800 μL 2.5% NaOH,振摇5 min,静置至分层,取蓝色上层液体于520 nm处进行紫外检测。用左旋紫草素标准溶液制定标准曲线后,计算悬浮细胞培养培养基中紫草素类化合物的含量[9]。
3 结果
3.1 新疆紫草2种细胞系的表型分析 新疆紫草红色系愈伤组织颜色深红,瘤状细胞团块;新疆紫草白色系愈伤组织为白色,细胞湿润,排列疏松,半透明状,2种细胞系均为生长迅速,遗传稳定的无性系。
新疆紫草红色系和白色系经过3~5代继代培养后均能形成稳定遗传的悬浮细胞系,悬浮系中白色系细胞团块疏松,红色系易形成较较紧密的颗粒状细胞团块。2种细胞系均属于分散性好,细胞形状及细胞团大小大致相同,而且生长迅速,稳定性好。
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