单位文秘网 2021-08-19 09:14:26 点击: 次
摘要:为获得在高温下能高效降解畜禽屠宰场废弃物的菌株,利用逐级梯度升温法,从畜禽屠宰场废弃物中分离筛选到菌株HL8103。对菌落形态、菌株形态、生理生化特性等进行探讨,并克隆其16S rDNA序列,进行系统发育学分析。同时进行菌株对屠宰废弃物适应性测试。结果表明, HL8103为热噬淀粉芽孢杆菌Bacillus thermoamylovorans,其形态特征为:革兰氏阳性,菌体呈杆状,直或弯曲,芽胞近圆形,近端生,孢囊膨大。该菌可耐95℃的高温,且最适生长温度为75~85℃,最适生长pH值为68~72,生长最佳时间为18 h,能适应屠宰废弃物的生长。
关键词:热噬淀粉芽孢杆菌;分离;鉴定
中图分类号:Q 93文献标识码:A文章编号:1008-0384(2018)04-413-05
Isolation and Identification of Bacillus thermoamylovorans
MIAO Furong,DONG Zhiyan,CHEN Xinzhu,LIU Jing*
(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou, Fujian350013,China)
Abstract:This study aimed to identify microbes that could, at high temperatures, efficiently degrade waste materials from livestock and poultry slaughterhouses. A stepwise gradient heating was applied to screen microorganisms and isolated HL8103.Through colony morphology, strain morphology, physiological and biochemical characteristics, 16S rDNA sequence, phylogenetic analysis. At the same time, the strain was tested for its suitability for livestock and poultry slaughterhouse waste. The results identified HL8103 as Bacillus thermoamylovorans, a grampositive with straight or curved rodshape bacterium that had near spherical spores, proximal birth, and inflated cysts. Meanwhile, HL8103 was tested for its adaptability on the slaughterhouse waste and found that it could grow well between 75℃ and 85℃ and withstand a temperature as high as 95℃. And, for optimal results, the medium was to be adjusted to pH 68-72 and fermented for 18 h.
Key words: Bacillus thermoamylovorans; separation; identification
嗜热菌是一类在45℃以上的高温环境中生长和繁殖的微生物,其中极端嗜热菌的最高生长温度高于70℃,最适温度高于65℃,最低生长温度高于40℃[1]。其细胞和酶独特的耐热性和与之相适应的分子结构,引起人们的广泛兴趣[2]。自Brock等[3]、ATKINSON等[4]于1969年首先分離出水生栖热菌Thermus aquaticus以来,已有超过30属80种近400株高温菌从各种高温自然环境及人造地热环境中被分离、鉴定。和致中等[5]分离得到极端嗜热性芽孢杆菌,其广泛分布在堆肥、地热区土壤、温泉、火山地区以及海底火山地等。极端微生物已成为可开发利用的重要微生物资源。研究表明,嗜热菌,尤其是嗜热杆菌,对多种污染物都具有降解潜力[6]。
屠宰场废弃物,不仅给环保增加压力,而且制约畜牧业的发展。因此筛选能高效降解含病死畜禽屠宰场废弃物的嗜热菌具有极大意义。然而目前仍未见降解屠宰场废弃物的极端嗜热菌的报道。本研究从屠宰场的废弃物中分离到极端嗜热菌,对该菌进行菌落形态、菌株形态、生理生化以及分子生物学鉴定,同时探讨其最适的生长条件,以期为屠宰厂和养殖场废弃物降解研究奠定理论基础。
1材料与方法
11材料
LB培养液(L):酵母粉10 g,蛋白胨10 g,牛肉浸膏5 g,NaCl 10 g,pH70,加蒸馏水定容至1 L。121℃灭菌30 min。
分离纯化固体培养基:LB培养液中加入20 g琼脂粉。121℃灭菌30 min。液体发酵培养基:同LB培养液。
主要试剂:琼脂粉、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏等。
12菌株的分离筛选
121采集样品采集生猪屠宰场废弃物堆肥的表面下50~80 cm处取品。
122样品预处理取上述样品装入已灭菌并盛装有无菌水的容器中,密封后振摇10 min,静置悬浮液,取上清液于3 000 r·min-1离心3 min 后,取上层菌悬液,备用。
123富集培养分别取菌悬液10 μL 接种于装液量10%的LB 培养液的250 mL三角瓶中,置于50℃恒温箱中培养震荡48 h,得扩大菌种培养液。
124逐级梯升温筛选取10 μL 扩大菌种培养液接种于装液量10%的LB 培养液的250 mL三角瓶中,按温度逐级递升进行培养,即后一温阶所用接种菌液取自前一温阶培养的菌液;在培养温度下,观察接种菌液后的LB 培养液,如出现浑浊,并用酶标仪测OD620 nm>05,则判定该菌可在此温度下生长,反之则排除。
125选定耐高温菌株取耐50℃以上的菌液,以生理盐水稀释(10-3),并均匀涂布于LB培养基固体内,75℃培养20 h;挑取有不同形态特征的单菌落,于75℃ LB培养基上分别扩繁后,以完全营养液体培养基加20%甘油混匀,于-80℃条件下保存。
13菌落形态和菌株形态观察
筛选获得的菌株,平板划线75℃分别培养18 h和25 h,在自然光下观察菌落形态;革兰氏染色后,观察菌落形态[7-9]。
14测量生长曲线
将所分离到的有代表菌株在60~95℃条件下,每组间隔5℃ LB培养液培养,间隔1 h取样测量OD620 nm,根据所得数据绘制其生长曲线,判断最适生长温度以及生长代时[10]。
15培养基初始pH对菌株生长的影响
将分离纯化的菌接种于装有30 mL培养液的250 mL三角瓶中,75℃,150 r·min-1,在水浴恒温振荡器中培养18 h,制备菌悬液。随后,准确吸取该菌悬液1 mL接种于装有不同pH梯度(55、60、65、70、75、80、85)培养液的250 mL三角瓶中,每一pH梯度重复3次。培养18 h后测培养液的OD620 nm,根据所得数据判断最适初始pH值。
16菌株对屠宰废弃物适应性测试
菌株接入LB培养液中进行培养,然后以1×106CFU·mL-1的菌浓度接种到10%(w/v)的LB培养液和屠宰废弃物水溶液中,置于75℃下培养18 h后用稀释平板法进行活菌计数。
17细菌16S rDNA基因序列测定
提取菌体的DNA,选用通用引物fDl(5′AGA GTr TGA TCC TGG CTC AG3′)和rP2(5′GGT TAC CTI"GTT ACG ACT T3′)[11]进行16S rDNA的PCR扩增及测序。
18数据分析
将获得的16S rRNA序列与GeneBank中的核酸数据进行比对。采用MEGA50软件,邻位链接法显示菌株HL8103与相关种的16S rDNA序列系统发育树,进行1 000次的相似度重复计算,发育树节点只显示Bootstrap值大于50%数值,上标“T”表示模式菌株。
19菌株生理生化特性
糖发酵试验、吲哚试验、淀粉水解试验、油脂试验等参考文献[12]的方法进行。
2结果与分析
21菌落形态和菌株形态
图1为分离筛选得到的极端嗜热细菌在菌落自然光下,LB培养基75℃培养18 h,菌落圆形、白色,凸起,表面光滑、湿润、边缘整齐。
图2为HL8103菌电镜下菌株形态图。该菌株形态特征为:菌体杆状,直或弯曲,(03~05)μm×(16~60)μm,单个或成对排列,芽孢近圆形,近端生,孢囊膨大。经检测,该极端嗜热细菌可以耐受95℃的高温,且最适生长温度为75~85℃,最适生长pH值为68~72,为革兰氏阳性。
22生长曲线的测定
生长曲线是反映细菌整个培养期间菌数变化规律的曲线[13]。图3为在培养温度75℃下的生长曲线,从中可以看出不同培养时间HL8103菌的生长规律。在培养过程中,菌体生物量随时间的变化而变化,0~4 h是菌体适应新环境的偿还期;4~16 h为生长繁殖迅速、细胞活力最大的对数生长期;16~20 h为稳定生长期,即菌体光密度值最高097;20 h时,菌体光密度值随之下降,由于自溶酶作用或有毒代谢产物积累,细胞裂解。因此表明HL8103菌的最适培养时间为18 h。
从图4可以看出,培養初始pH对HL8103菌的生长有较大的影响。在供试pH55~72范围内,菌体生物量随初始pH的提高而提高,当初始pH68~72时,菌体光密度值最高093;因此HL8103菌的最适初始pH为68~72。
25DNA的序列信息及其系统发育学分析
在RDP数据库(https:// rdp.cme.msu.edu/)中进行Blast。经过分析,HL8103和与之参比的芽孢杆菌属相应标准菌株同源相似度均在98%以上,因此可初步判断菌株HL8103属于芽孢杆菌属。供试菌株HL8103与模式菌株Bacillus thermoamylovorans CNCM I1378 16S rDNA序列的同源性达到100%(图5),因此,鉴定HL8103为热噬淀粉芽孢杆菌Bacillus thermoamylovorans。
3讨论与结论
利用逐级梯度升温法,从畜禽屠宰场废弃物中分离筛选到菌株HL8103。经菌落形态、菌株形态、生理生化特性的研究,并克隆其16S rDNA序列,进行系统发育学分析。鉴定为HL8103为热噬淀粉芽孢杆菌Bacillus thermoamylovorans。该菌生长特性为,生长温度范围为65~95℃,最适生长条件为75~85℃,最高生长温度可以达到90℃以上,生长最佳时间18 h,最适pH68~72。该菌株适应屠宰废弃物的生长。
热噬淀粉芽孢杆菌亦为极端嗜热性芽泡杆菌,国内未见该菌相关的研究报道。国外对该种类的菌研究主要在淀粉发酵产有机酸[14-16]和食品灭菌效果指示菌[17]的方面。本研究工作的开展,可为进一步研究畜禽养殖场废弃物高效降解奠定理论基础。
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