单位文秘网 2021-07-10 08:09:26 点击: 次
农业科学院微生物实验室保存菌株。
1.2 试验设计与实施
先利用单因素实验方法筛选出K9的碳源、氮源和无机盐离子,再利用响应面法对其培养基进行优化,从而得出培养基最佳成分和浓度。然后进一步用响应面法中的旋转中心组合设计对其进行优化,以获得菌株生长的最佳培养浓度。
2 结果与分析
2.1 降碱菌K9在NB培养基中的生长曲线
以活菌数为衡量标准,每隔3 h取样1次,将样品稀释涂平板,培养48 h,检测活菌数,绘制降碱菌K9在NB培养基中的生长曲线(图1),可以看出降碱菌K9在NB培养基中连续培养48 h,在0~9 h为菌体的延滞期,菌体生长9 h之后进入对数生长期,菌体浓度迅速增长,42 h左右达到最高,为35×108 cfu/mL,48 h之后进入衰亡期。
2.2 降碱菌K9最适培养基的筛选
2.2.1 不同碳源、氮源对降碱菌生长的影响。不同碳源对降碱菌K9生长的影响结果见表1,可知最佳碳源为可溶性淀粉,菌浓度达到7.30×108 cfu/mL。不同氮源对降碱菌的影响结果见表2,可知最佳有机氮源为蛋白胨,菌浓度达到4.97×108 cfu/mL。最佳无机氮源为硝酸铵,菌浓度达到6.94×107 cfu/mL。而不添加氮源物质时降碱菌的生长情况最差,菌浓度仅为1.00×106 cfu/mL。因此,选定可溶性淀粉、蛋白胨和硝酸铵作为最佳的碳源、氮源进行响应面分析试验[1-4]。
2.2.2 不同无机盐离子对降碱菌生长的影响。
(1)无机盐单因子筛选。通过对无机盐培养基中的8种无机盐离子进行逐一筛选发现不同无机盐离子的有无对降碱菌生长的影响各不相同。从表3可知,当无机盐离子中无K2HPO4时菌浓度最小,为2.35×103 cfu/mL,说明该无机盐对降碱菌的生长影响最大,同理分别缺少ZnSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、CaCl2、FeSO4·7H2O、MnSO4·5H2O时对降碱菌的生长影响较大。而缺少CuSO4和NaCl时对降碱菌的生长基本没有影响。因此,影响降碱菌生长的无机盐离子有K2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2、MnSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O。然后用正交试验来进一步确定每种无机盐的含量[5-9]。
(2)正交试验确定无机盐的含量。通过对不同无机盐离子进行筛选,选取影响降碱菌生长的6种无机盐离子作为优化因素,每个因素选取5个水平,以菌浓度为优化指标按表4进行L25(56)的正交试验,结果见图2。由效应曲线图可以看出K2HPO4和MgSO4·7H2O 2种物质的含量没有达到最大值。
(3)2种主要无机盐进行筛选。选取K2HPO4的含量分别设4个水平,MgSO4·7H2O的含量分别设3个水平如表5所示。然后加入5%的可溶性淀粉和3%的硝酸铵制成100 mL的培养液,并调节pH值至7.2~7.4,装入250 mL的三角瓶中。灭菌后分别接入8%的50 mL菌悬液在150 r/min的摇床上,28 ℃恒温培养48 h后,进行菌落计数[10-12]。
由表5中结果可知,2种无机盐的最佳组合为K2HPO4 0.15 g/L,MgSO4·7H2O 0.125 g/L,此时菌浓度为3.13×106 cfu/mL,远大于其他组合。因此,无机盐离子的最佳浓度为K2HPO4 0.15 g/L,MgSO4·7H2O 0.125 g/L,ZnSO4·7H2O 0.001 5 g/L,FeSO4·7H2O 0.001 g/L,CaCl2 0.005 g/L。
2.2.3 响应面分析优化烟草节杆菌K9培养基。进行K9菌体浓度多元二次模型方程的建立及检验,根据试验设计进行了20组试验,其结果见表6。
表6中,x1=(X1-25)/10;x2=(X2-5)/2;x3=(X3-5)/2。
对试验数据进行二次多项回归拟合,获得K9菌体浓度的二次多项式回归方程为:
Y=35.14-3.37x1+0.69x2-1.06x3-0.46x1x2-3.09x1x3-0.69 x2x3-2.87x12-5.63x22-1.70x32
式中,Y为预测响应值,x1、x2、x3分别为可溶性淀粉、蛋白胨以及硝酸铵的编码值。由K9菌体浓度的二次多项式回归方程得出K9的菌体浓度预测值(表6),方差分析结果见表7。
由表7可知,该模型极显著(P<0.000 1),失拟项在α=0.1水平上不显著,模型的校正确定系数RAdj2=0.984 7,表明模型能解释烟草节杆菌K9菌体浓度响应值的变化。
3 结论与讨论
我国烤烟烟碱的平均含量为3%~4%,不同部位的烟叶中上部烟叶的烟碱含量最高,因而在叶组配方中一般因其烟碱含量较高而难以应用。近年来,随着消费者对自身健康的关注度提高,对于烟草的烟碱含量也有较高的要求。目前卷烟产品正在逐渐向低烟碱含量的方向发展,并且已经出现了许多降低烟草中烟碱含量的技术方法,包括一些农业技术措施及烟叶浸提法等,但是上述降低烟碱含量的技术方法在实施过程中也降低了烟草的综合品质,而应用微生物降解烟碱技术则具有高效且负面作用小的特点,因此研究利用微生物降低烟叶中的烟碱对于国内烟草业的发展具有重要意义。
本研究通过对菌体在NB培养基中的生长曲线的测定发现在NB培养基中菌体的延滞期时间相对较长,进入对数生长期时间也较长,考虑到菌体的最佳生长时间较长,一般为42 h,为了节省细菌培养所需要的时间以及培养细菌材料的使用,本试验采用制作菌悬液直接接入改良培养基中对碳氮源进行筛选。本次试验得到烟碱节杆菌的最佳培养基为无机盐离子(K2HPO4 0.15 g/L,MgSO4·7H2O 0.125 g/L,ZnSO4·7H2O 0.001 5 g/L,FeSO4·7H2O 0.001 g/L,CaCl2 0.005 g/L)+35.0 g/L可溶性淀粉+5.14 g/L蛋白胨+3.73 g/L硝酸铵。在优化试验条件下,得出K9菌体浓度为32.4×108 cfu/mL,比优化前用NB培养基得到的菌浓度(7.4×108 cfu/mL)提高了4.4倍,从而为研究真空冷冻干燥降烟碱菌剂奠定了基础。
由于烟碱的毒性较高,作为高毒性的化合物,能够有效降解烟碱的微生物种类不多。根据目前的研究结果,能够有效降解烟碱的菌类主要包括烟草节杆菌、争论产碱菌、球形节杆菌、噬烟碱节杆菌、恶臭假单胞菌、纤维单胞菌等,同时有相关报道称部分苍白杆菌属的细菌由于可以破坏芳香化合物的结构而具有降解烟碱的作用,但相关验证性试验结果未见报道,其降解烟碱的具体机理、作用及安全效果有待进一步研究。利用部分烟碱降解微生物能够代谢烟碱的生物特点,可以有效降低卷烟以及生活环境中的烟碱含量,全球各地的科研工作者已经开展了大量的相关研究,包括对代谢烟碱微生物的种类、代谢途径、分子生物学原理及酶学进行深入研究。自然界中的烟碱代谢微生物能够以烟碱作为碳源与氮源,其代谢过程是一个复杂的生理、生化过程,主要包括吡啶途径、吡咯途径、脱甲基化途径、吡啶途径与吡咯途径的混合途径等,不同的微生物种类其代谢途径也不同,并且据最新研究发现仍然存在未知的烟碱代谢途径,有待进一步探明。微生物对烟碱进行代谢的过程主要在于烟叶的醇化过程,不仅能降低烟碱的含量,减少刺激性,还能够增加烟草的香气,从而提高烟草的安全性。因此对降解烟碱微生物的研究意义显著[13-20]。
4 参考文献
[1] 李梅云.烟碱的微生物降解研究进展[J].微生物学杂志,2006,26(3):94-97.
[2] 马林,张峻松,曾晓鹰,等.产烟碱脱氢酶菌株节杆菌Z3的发酵条件研究[J].烟草科技,2007(10):61-64.
[3] 袁勇军,陆兆新,别小妹,等.DN2菌降解烟碱的动力学及其应用研究[J].中国生物工程杂志,2006(3):52-55.
[4] 万虎,赵海刚,宋纪真,等.高浓度烟碱降解菌的筛选、鉴定及降解特性[J].烟草科技,2009(4):51-54.
[5] 雷丽萍,夏振远,郭荣君,等.降烟碱节杆菌发酵条件研究[J].中国烟草科学,2006(3):48-50.
[6] 李珏,赵建新,田丰伟,等.一株降烟碱细菌的筛选、鉴定及降解特性研究[J].中国生物工程杂志,2007(11):87-90.
[7] 李雪梅,陈育如,骆跃军,等.两株芽胞菌对烟草废料烟碱与绿原酸降解的研究[J].生物加工过程,2005(4):61-64.
[8] 袁勇军,陆兆新,黄丽金,等.烟碱降解细菌的分离、鉴定及其降解性能的初步研究[J].微生物学报,2005(2):52-54.
[9] 杨虹琦,周冀衡,罗泽民,等.微生物和酶在烟叶发酵中的应用[J].湖南农业科学,2004(1):65-68.
[10] 王春利,罗昭标,寇霄腾,等.烟碱的微生物代谢研究进展[J].郑州轻工业学院学报(自然科学版),2011(4):32-36.
[11] 杨艳坤,席宇,张广乐,等.微生物降解尼古丁的分子生物学研究进展[J].中国烟草科学,2010(4):84-89.
[12] 袁勇军,陆兆新,戚向阳.菌株DN2对烟草薄片制备液中烟碱的降解[J].生物工程学报,2009(6):104-109.
[13] 侯轶,李友明,胡松青.烟草薄片生产废水中烟碱的厌氧降解及反硝化强化[J].农业工程学报,2009(9):274-278.
[14] 金云峰,王莎莎,张建波,等.生长温度对烤烟生物碱含量及烟碱代谢相关酶基因表达的影响[J].热带作物学报,2016(3):128-140.
[15] 王威威,席飞虎,杨少峰,等.烟草烟碱合成代谢调控研究进展[J].亚热带农业研究,2016(1):64-69.
[16] 李文正,宋中邦,高玉龙,等.烟碱合成分子调控研究进展[J].安徽农业科学,2013(14):51-53.
[17] 周通,谢晓阳,徐波,等.降解烟碱细菌的分离·筛选及初步鉴定[J].安徽农业科学,2008(36):204-206.
[18] DEWEY R E,SIMINSZK Y B,BOWEN S W,et al.烟碱N-脱甲基酶基因的功能描述[J].中国烟草学报,2007(3):21.
[19] 徐晓燕,孙五三,李章海.烟碱的生物合成及控制烟碱形成的相关因素[J].安徽农业科学,2001(5):103-104.
[20] 龙章德,韦方立,李俊芳,等.一株高浓度烟碱降解菌的筛选、分离和初步鉴定[J].基因组学与应用生物学,2013(5):57-60.
(责任编辑:单位文秘网) )地址:https://www.kgf8887.com/show-164-63077-1.html
上一篇:埃利亚松:以光影“论道”
版权声明:
本站由单位文秘网原创策划制作,欢迎订阅或转载,但请注明出处。违者必究。单位文秘网独家运营 版权所有 未经许可不得转载使用