单位文秘网 2021-07-09 08:09:20 点击: 次
【摘要】目的:观察硝化应激重要硝化剂过氧亚硝基阴离子(ONOO-)对肝原代细胞的体外损伤作用及机制研究。方法:通过不同浓度ONOO-供体SIN-1作用于肝原代细胞24h,探索SIN-1的有效作用剂量,同时加入ONOO-清除剂FeTMPyP处理确认是否是ONOO-对肝原代细胞产生影响。将肝原代细胞分为Control组,SIN-1作用组和ONOO-清除剂组,用MTT法分别检测各组肝细胞存活率,LDH检测细胞坏死情况,Western Blot法检测细胞内ONOO-生成印记蛋白——3-硝基酪氨酸(3-NT或NT)表达情况。结果:200μM的SIN-1刺激24h使肝细胞存活率明显下降,同时检测该浓度下的肝细胞培养基中LDH的活性发现也明显升高。WB结果显示SIN-1组细胞NT蛋白表达明显升高。结论:ONOO-能够介导肝细胞硝化应激,造成原代肝细胞的损伤。
【关键词】硝化应激;肝原代细胞;过氧亚硝基阴离子
【中图分类号】R453【文献标识码】A【文章编号】1004-4949(2013)12-221-02
硝化应激(NitrativeStress)[1]指机体内活性氧簇与活性氮簇共同生成增加时导致机体内产生大量的硝化能力极强的一类硝化物质,如过氧亚硝基阴离子等等,进而对机体内的一些蛋白质产生硝化作用或者对细胞的核酸物质产生硝化作用,进而引起一些的机体的病理变化。研究发现,病理情况下,在体内产生过量的超氧阴离子等氧化物质的同时体内体内诱导型一氧化氮合酶表达及活性增加,催化产生大量NO;NO与氧化应激反应的产物超氧阴离子(O2-)结合后产生过氧亚硝基阴离子(Peroxynitrite,ONOO-)等硝化能力很强的物质,从而使机体产生硝化应激[2],体内多种途径可导致蛋白质酪氨酸残基的硝化,其中经由过量NO与.O2-反应生成的ONOO-介导的蛋白质硝化被认为是最主要的途径之一[3],主要的是致使机体内一些蛋白质酪氨酸残基发生硝基化,生成硝基酪氨酸(nitrotyrosine,NT),而NT也被认为是硝化应激的印记蛋白。近年来研究表明,在一些肝脏疾病过程中或者病理情况下会导致肝脏发生硝化应激的现象[4],而硝化应激也被认为参与了多种疾病如酒精性脂肪肝的病理生理过程中[5]。但是对于硝化应激是否对肝细胞产生直接的作用以及其作用的具体机制尚不完全清楚。本项研究采用ONOO-供体3-吗啉斯德酮亚胺(3-morpholinosydnonimine,SIN-1)体外直接作用于原代培养的小鼠肝原代细胞,观察ONOO-对肝原代细胞的直接作用,并探讨其作用的机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物:
8周龄健康雄性C57小鼠,由内蒙古医科大学动物部提供。
1.2 主要试剂及仪器:
主要试剂:William’s E培养基购自美国Gibco/BRL公司;胎牛血清(FBS)购自美国Hyclone公司;噻唑蓝(MTT)和SIN-1均购自美国Sigma公司;0.05%胰酶-EDTA、购自美国Invitrogen公司;NT一抗购自美国abcame公司;5,10,15,20-四羟甲基(N-甲基-4‘-吡啶基)铁卟啉(FeTMPyP)购自美国Cayman Chemical公司;鼠尾胶原购自美国BD公司;LDH检测试剂盒购自南京建成公司。
主要仪器:德国Heraeus常温水平离心机,美国MD酶标仪,美国Bio-rad电泳仪。
1.3 实验方法
1.3.1酶消化法取小鼠肝原代细胞,培养待用:
将肝细胞以每孔5×103个接种于96孔培养板,每孔加培养基100μl,待生长至单层融合后,低血清(0.5%FBS)处理12h后进行不同处理24h。细胞分组:空白对照组,SIN-1作用组(先采用0至500μMSIN-1刺激细胞,最终选取200μM作为刺激细胞的浓度),SIN-1+FeTMPyP(10μM)作用组,FeTMPyP(10μM)单独作用组。药物作用24h后每孔加入5mg/mL MTT溶液10μl,继续培养4h,弃去上清后每孔加入150μl二甲基亚砜(DMSO),振荡5min使结晶物充分溶解,用酶标仪测定570nm波长各孔吸光度(OD)值。细胞存活率=处理组细胞OD值/正常对照组细胞OD值(药物浓度为0时的细胞存活率)×100%。
1.3.2 LDH检测试剂盒检测细胞培养基LDH活性:
取对照组,SIN-1作用组以及清除剂干预组细胞培养基检测其中LDH的活性。具体方法参照南京建成LDH活性测定试剂盒说明书。
1.3.3 Western Blot方法检测各组细胞NT的表达水平:
刮取各组处理的细胞用RIPA裂解液提取总蛋白。BCA法测定各组细胞样品的蛋白浓度。取每组约80μg蛋白样品进行SDS-PAGE。转膜,5%BSA中室温封闭1h,加入1抗稀释液(1:1000),4℃孵育过夜。TBST洗膜3次,每次10min,再加辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液室温孵育1h。TBST洗膜三次,每次10min,于暗室内曝光。采用Image G软件扫描各个条带的灰度值进行统计学分析。
1.4 统计学处理:
数据以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS12.0软件进行统计学分析,各组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),LSD法进行组间两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 小鼠肝原代细胞培养及SIN-1对原代肝细胞的作用:
用不同处理方式处理肝原代细胞24h后,采用MTT方法检测各组细胞的存活率。结果发现SIN-1作用组(200μM)能造成肝原代细胞存活率明显下降(见表1)。结果显示同时加入ONOO-清除剂FeTMPyP(剂量为10μM,参考其他的研究[6])则能够抑制该现象;我们观察了该种清除剂对细胞的单独作用(见表2)单独加入ONOO-清除剂时,对肝细胞存活率并无显著性影响。
2.2ONOO-供体SIN-1刺激及ONOO-清除剂对肝原代细胞损伤作用: 收集各处理组细胞的培养基,检测培养基中LDH的活性。结果显示SIN-1作用组LDH活性较对照组显著增加;同时加入ONOO-清除剂FeTMPyP后细胞培养基中LDH活性明显下降,与正常组无统计学差异(图2)。
2.3 Western Blot法检测各处理组细胞内NT的表达水平:
细胞刺激24h后,提取各组细胞蛋白,用Western Blot法对各组蛋白中NT水平进行检测,发现SIN-1刺激细胞后,细胞蛋白中NT的表达水平明显升高,加入清除剂后NT的水平降至正常水平(图3)。
注:*,P<0.05,vs.control组;#,P<0.05,vs.SIN-1组
图3 ONOO-供体SIN-1刺激及清除剂FeTMPyP干预对肝脏原代细胞内NT含量的影响
3讨论
硝化应激参与了多种肝脏疾病的病理生理过程。有研究表明在酒精性肝病的发生发展过程中硝化应激参与了肝脏组织的损伤[7],在体内发生氧化应激的同时,体内诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达也明显升高,导致体内硝化应激的发生。ONOO-既是一种强氧化剂,又可以作为硝化剂,硝化蛋白质,影响蛋白质酪氨酸激酶、丝裂原活化蛋白激酶等信号分子的级联反应,从而导致基因转录和蛋白质活性的改变,产生细胞损伤及参与一系列病理生理过程。本研究采用的是离体培养的原代肝细胞,该模型较好的模拟了在生物体内肝细胞在硝化应激情况下的损伤表现。研究发现SIN-1能够降低肝细胞的存活率,进一步检测其培养基上清中的LDH活性发现ONOO-能够使细胞培养基中的LDH活性明显升高说明SIN-1导致细胞的坏死,这提示ONOO-可能是肝细胞的存活率下降的原因,而通过加入ONOO-清除剂FeTMPyP后则能抑制以上情况;进一步通过Western Blot方法检测各组细胞中硝化应激印记蛋白NT的表达情况,结果发现SIN-1刺激细胞后其表达NT的水平明显升高,而这种现象能够被ONOO-清除剂FeTMPyP抑制,也进而说明了是SIN-1产生的ONOO-对肝细胞造成了损伤作用。本研究表明ONOO-能够介导肝原代细胞发生硝化应激,致使肝原代细胞发生坏死,导致肝细胞存活率下降。
之前对于一些肝脏疾病的研究很多关注在肝脏发生的氧化应激水平上,而越来越多的研究发现,在肝脏发生的一些病理生理过程中伴随着体内iNOS的表达升高,在体内产生的高水平的氧化应激的同时,生成的活性氮簇与活性氧簇结合后产生氧化能力更强的硝化物质,导致了体内的一些蛋白或者是核酸物质的硝基化,进而导致进一步的病理生理学过程。已有研究发现某些蛋白的硝基化会引起肝脏的损伤[8],这些研究与本研究的所观察的现象基本一致,都是硝化应激导致的蛋白的硝基化程度增加,进而使细胞受损。随着对硝化应激认识的增加,对于硝化应激在肝脏疾病的发生的中的重要作用也逐渐受到关注;另外有些研究者发现在一些信号通路中,蛋白的硝化也影响了其发挥重要作用,从而导致信号通路的受阻进而产生一系列病理情况。而目前对于肝脏组织因硝化应激导致损伤的机制研究仍不十分明确,一些涉及硝化的蛋白或者核酸最终导致肝细胞病理改变的机制仍然需要进一步的研究,本研究只是初步在离体水平探讨了硝化应激对肝原代细胞的损伤作用,进而研究参与硝化反应的蛋白或者体内导致硝化应激水平升高的因素以及硝化应激发生后如何采取积极措施能够减少硝化应激对肝脏组织甚至是整个机体的损伤都将是意义重大的问题。
参考文献
[1]Rafael Radi. Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101:4003-4008.
[2]Mayo JN, Beard RS Jr, Price TO, et al. Nitrative stress in cerebral endothelium is mediated by mGluR5 in hyperhomocysteinemia [J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2012, 32:825-834.
[3]El Assar M, Angulo J, Vallejo S, et al. Mechanisms involved in the aging-induced vascular dysfunction[J]. Front Physiol, 2012, 132: 1-13.
[4]Abdelmegeed MA,Jang S,Banerjee A,et al. Robust protein nitration contributes to acetaminophen-induced mitochondrial dysfunction and acute liver injury. Free Radic Biol Med, 2013, 60:211-222.
[5]林琳,周俊英.硝化应激在酒精性肝病中的作用[J]. 国际内科学杂志,?2009,36: 264-267.
[6]李海玲,张燕,卢乃浩,等.铁过载促进小鼠肝组织发生蛋白质酪氨酸硝化.中国生物化学与分子生物学报,2008, 24:569-573.
[7]周俊英,林琳,王玮.酒精性肝病大鼠模型肝组织中硝化应激指标表达增强[J]. 基础医学与临床,2010, 30:773-774.
[8]Turko IV, Murad F. Protein nitration in cardiovascular diseases [J]. Pharmacol Rev, 2002,54:619-634.
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