单位文秘网 2021-07-10 08:11:07 点击: 次
组织修复、改善组织局部血液循环和分解脓液等药理作用。hLYZ
还能与带负电荷的病毒蛋白直接作用,并能与DNA、RNA和脱辅基蛋白形成复盐而使病毒
失活[1]。关于hLYZ的抗肿瘤作用也有很多报道[2-3]。因此,hLYZ具有独特的药理作用和广
泛的临床应用价值。
l 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种和质粒
E.coliJM105作为受体菌。质粒pBV220由由扬州大学生科院孙怀昌教授实验室提供[4]。含有人溶菌酶基因编码顺序的噬菌体Ml3mpl8-a1作为PCR扩增模板由本实验室构建[5]。
1.1.2 试剂和酶
实验所需各种限制酶均购自北京协和医科大学医学科技开发公司,T4DNA连接酶,Taq DNA聚合酶,Klenow大片段,4dNTP混台物购自美国Promega公司,其它试剂为国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 受体菌的制备
质粒的提取分离、重组及转化按Sambrook等人的方法进行[6]。
1.2.2 多聚酶链反应(PCR)
噬菌体Ml3mpl8-a1作为PCR扩增模板;根据GenBank上已发表的人溶菌酶基因序列(AK311779)设计能特异性扩增人溶菌酶编码基因的引物序列。5’端引物P1:5’- AGGAATTCATGAAAGTTTTCGAACG-3’ ,(引物的5’端带有人工设计的EcoR I酶切位点GAATTC及保护性碱基AG);3’端引物P2:5’- ATGCATGCTCATTAAACACCGC-3’ (引物的5’端带有保护性碱基TA)。在20μL PCR反应体系中含模板DNA660ng,引物Pl、P2各为1pmol/L,4dNTP 200μm/ L,10×TaqDNA聚合酶缓冲液2μL混匀,94℃,4min.加Taq DNA聚合酶lμL混匀,加石蜡油40μL,94℃,40s,45℃,40s,72℃,lmin,5个循环后改为94℃,40s,55℃,40s,72℃,1min,25个循环,最后一个循环72℃延长到10min.共30个循环。然后加lμL Klenow大片段,37℃,30min,70℃,10min,取2μLPCR反应物通过琼脂糖凝胶电泳后现察结果。PCR扩增产物经过酚、氯仿的萃取抽提,乙醇沉析后溶于TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCL pH8.0,0.1mmol/L EDTA)中备用。
1.2.3 PCR产物与pBV220基因重组、转化
pBV220质粒DNA经BamHI酶切后,用T4噬菌体聚合酶补平3’端,然后pBV220质粒DNA和上述PCR产物再分别经EcoR I酶切后在低熔点胶上回收,按1.5的比例在T4DNA连接酶的作用下,于14℃水浴内,约24h 进行重组连接,然后转化至大肠杆菌JM105中,37℃静止培养,16h后观察结果。
1.2.4 重组pBV220质粒在大肠杆菌中的表达及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定
含有pBV220质粒的E.coli过夜培养,按1∶50稀释转入LB培养液中,30℃,200rpm振荡培养至OD260为0.5~0.6后,42℃ 诱导4h,取1.5ml培养物中所得到的菌体悬浮液于50μL Laemmli缓冲液中[7],100℃加热3min后离心(14000r/min,10min),取上清液35μL 在15%的SDS-PAGE中进行电泳分析。
1.2.5 表达产物的免疫学鉴定
用Western Blotting来确证表达产物,表达产物用SDS-PAGE分离后,在Bio-Rad电转移至PVDF膜上,免疫测试按Promega提供的方法进行,抗人溶菌酶血清的制备参见文献[8]。
2 结 果
2.1 PCR和人溶菌酶表达质粒的构建
1 2 3 4 5
图1 重组质粒pBV-H Ly的酶切分析
如实验方法中所叙述,PCR酶切后的产物与载体质粒重组,能使目的基因在温控串联启动子PRPL的调控下得到表达。如图1所示,第1泳道为pBR322 mark,第2、3、4泳道为酶切片段,新构建的重组质粒经EcoRI和HindⅢ酶切检查形成4个片段,分别为2.72kb,0.784kb,0.423kb,0.125kb 与所预期的结果完生一致。
2.2 人溶菌酶在大肠杆菌中的表达
按方法1.2.4中所描述那样,样品经SDS-PAGE电泳后,经考马斯亮蓝染色的结果如图2,可以看到人溶菌酶蛋白的表达。为了进一步确证表达产物,我们进行了Western Blotting免疫印迹杂交。从图3可进一步证实了人溶菌酶在大肠杆菌中的表达。
图2 人溶菌酶蛋白SDS-PAGE分析
图3 人溶菌酶免疫印迹分析
3 讨 论
人溶菌酶蛋白的表达受到其基因插入表达质粒不同位置的影响很大,笔者曾在表达质粒的BamHI位点插入人溶菌酶基因,但表达效果不明显。后从EcoRI位点插入,表达量明显增加,说明核糖体结合位点(SD)与基因的起始密码子(ATG)之间的距离对表达质粒表达酶蛋白时有影响。
在设计引物时,将保护基AG、TA分别引入到P1、P2中,为的是使5’端进行酶切后产生有效的粘末端及保留3’端的SphI酶切位点。
为了使酶产物的表达得到进一步提高,可通过PCR方法来调整SD 与基因上的ATG之间在表达质粒上的距离而达到最佳表达效果,同时也有必要进行对含有重组质粒的大肠杆菌生长的最适产酶条件进行研究。
参考文献
[1] 王佃亮.重组人溶菌酶研究进展[J].中国生物工程杂志,2003,23(9):59.
[2] Yang X,Li W,Guo L.The study on the anti-tumor function of lysozyme in the regional lymph nodes of laryngocarcilnoma patients[J].L Chuang Er Yan Hou Ke Za zhi,1998,12(2):51.
[3] SaraGPharmacological aspects and therapeutic application of lysozymes[J].EXS,1996(75):433.
[4] 孙怀昌,张泉,施伟庆等.人溶菌酶cDNA的克隆及其在小鼠体内的表达[J].中国兽医学报,2004,24(2):157.
[5] 钱世钧,于颖,田开荣等.生物工程学报[J].1994,l0(1):34-38.
[6] J.F. Sambrook and D.W. Russell, ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001,2100 pp,soft cover.
[7] Laemmli C K.Nature[J].1970(227):680-685.
[8] 孟广震,张树政.酶学研究技术[M].北京:科学出版社,1987:125-129.
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