单位文秘网 2021-07-17 14:03:18 点击: 次
摘要:以怀菊花中的优良品种小黄菊为试材,研究了玻璃化超低温保存对怀菊花再生苗形态及生理指标的影响。结果表明,与常温苗相比,继代培养的玻璃化超低温保存再生苗前期(0~15 d)生长较慢,中期(15~30 d)开始快速生长,至45 d时,二者长势基本一致;叶片的可溶性糖、可溶性蛋白质和叶绿素含量均没有显著的差异。玻璃化超低温保存能够保持其形态和生理的稳定性。
关键词:怀菊花;超低温保存;再生苗;形态;生理指标
中图分类号:S325.1+2;S682.1+1 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2011)03-0533-03
Effect of Cryopreservation by Vitrification on Morphology and Physiology of Huaiqing Chrysanthemum (Dendranthema morifolium) Regeneration Plantlets
ZHAO Xi-ting1,2,SONG Ping-ping1,WANG Miao1,ZHAO Yue-li1,GUO Jing1,LI Ming-jun1,2
(1. College of Life Science, Henan Normal University, Xinxiang 453007,Henan,China; 2. Engineering Technology Research Center of Nursing and Utilization of Genuine Chinese Crude Drugs,University of Henan Province,Xinxiang 453007,Henan,China)
Abstract: In this paper, Xiaohuangju, a superior variety of Huaiqing chrysanthemum(Dendranthema morifolium), was taken as materials, to study the effects of cryopreservation by vitrification on morphology and physiology of Huaiqing Chrysanthemum regeneration plantlets. The results indicated that comparing with the plantlets preserved at room temperature, the plantlets after cryopreservation by vitrification grew slowly in early phase (0~15 d); and then began to grow faster in medium term (15~30 d); till the 45th day, they seemed congruously in growth. There were no significant difference between the plantlets after cryopreservation by vitrification and the plantlets preserved at room temperature on the average increasing value of internodal length, plant height, leaf number, and the contents of soluble sugar, soluble protein and chlorophyll. Thus morphological and some physiological stability could be maintained via vitrification in Huaiqing chrysanthemum.
Key words: Huaiqing chrysanthemum(Dendranthema morifolium);cryopreservation;regeneration plantlets;morphology;physiology index
怀菊花[Huaiqing chrysanthemum (Dendranthema morifolium)]是“四大怀药”之一,有很高的药用价值,《中国药典》2000年版记载:菊,甘苦,微寒;归肺、肝经;具有散风清热、平肝明目之功效[1]。但目前怀菊花种质资源仍采用大田种植保存的方式,这种方式易遭受病虫害的侵袭和极端环境的威胁,长期以来种质混杂,品种流失严重。超低温保存(Cryopreservation)是目前植物种质资源长期稳定保存的最好方法[2],自1973年Nag和Street首次在液氮中成功保存胡萝卜悬浮细胞以来,超低温保存技术已取得了突破性进展,许多植物材料如原生质体[3]、愈伤组织[4]、体细胞胚[5]、茎尖分生组织[6-10]、芽[11-14]、花粉[15,16]等植物组织和器官采用超低温保存都已取得成功[17],并且,大部分已实现植株再生。近年来,菊花的超低温保存在国外已有报道[7,18],但是对其超低温保存后再生植株形态及生理方面的研究鲜见报道[5,6]。自2006年以来,我们以怀菊花中优良品种小黄菊为试材,开展了玻璃化超低温保存怀菊花种质的研究,已成功建立了怀菊花的玻璃化超低温保存技术体系,在此基础上,从形态、生理、同工酶和DNA等水平上对建立的体系进行了可行性研究,该文是报道形态和生理方面的内容。
1材料与方法
1.1材料
河南师范大学生命科学学院“四大怀药”组织培养研究室继代培养的小黄菊[Huaiqing chrysanthemum(Dendranthema morifolium) cv. Xiaohuangju]试管苗(CK)和经过玻璃化超低温保存的继代培养2次的小黄菊再生苗(Regeneration plantlet after cryopreservation,RPC)。
1.2方法
1.2.1玻璃化超低温保存的小黄菊再生苗的获得将继代培养一定时间的试管苗低温锻炼几天后,在无菌条件下切取1 cm左右的带芽茎段,放入含有一定蔗糖浓度的MS基本培养基中于4℃下预培养3 d,然后将材料切成2 mm左右的带芽茎段,室温下用装载液装载20 min之后,加入玻璃化溶液(Protectant of vitrifiable solution,PVS),并置于0℃下脱水60 min,迅速投入液氮保存;在液氮中保存1 d后,立即放入温水浴中快速化冻3 min,化冻后用MS液体培养基洗涤2次,最后转入再生培养基中,先于暗处培养,再转到光下培养,可获得超低温保存后的再生苗。将获得的再生苗进行2次继代培养,并进行形态学观测,培养至45 d时进行相关生理指标的测定。
1.2.2形态学观测将经过玻璃化超低温保存后的小黄菊再生苗与继代培养的常温苗切取2~3 cm左右的茎段接种到再生培养基上,25℃光下培养。分别对光下培养0、15、30、45 d的再生苗和常温苗进行形态学观察,并定期测量茎节长、株高和叶片数。平均茎节长(株高/叶片数)增加值=观测当天的平均茎节长(株高/叶片数)-0 d的平均茎节长(株高/叶片数)。单株试管苗为样本,10次重复。
1.2.3生理指标测定对光下培养45 d的超低温保存后再生苗和常温苗叶片中可溶性糖、可溶性蛋白质和叶绿素含量进行测定。可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法[19],可溶性蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法[19,20],叶绿素含量测定采用Arnon法[21]。
1.2.4数据处理及分析方法采用配对样本t测验方法。
2结果与分析
2.1玻璃化超低温保存对怀菊花再生苗形态的影响
如图1和图2所示,与常温苗相比,再生苗在继代培养的前期(0~15 d)生长较慢,中期(15~30 d)开始快速生长,之后,二者生长速度相当,至45 d时,长势基本一致;且各时期二者的平均茎节长、株高和叶片数增加值均没有显著差异。
2.2玻璃化超低温保存对怀菊花再生苗叶片一些生理指标的影响
2.2.1玻璃化超低温保存对怀菊花再生苗可溶性糖和可溶性蛋白质含量的影响由表1可以看出, 怀菊花经过玻璃化超低温保存后的再生苗叶片中可溶性糖含量比常温苗略高,可溶性蛋白质含量和常温苗基本一致。经方差分析两者均没有显著差异,说明玻璃化超低温保存没有改变怀菊花叶片的可溶性糖和可溶性蛋白质含量。
叶片的叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量均比常温苗略高,但差异没有达到显著性水平。说明玻璃化超低温保存没有改变怀菊花叶片的叶绿素含量。
3讨论
超低温保存是指在超低温条件(一般指液氮低温-196℃)下保存种质的技术,通常称为液氮保存,是目前惟一可行的、在保存过程中不需继代就可以实现植物种质资源长期保存的理想方法。在液氮条件下,几乎所有的细胞代谢活动和生长过程都停止进行,而细胞活力和形态发生的潜能可保存,这样植物材料处于相对稳定的生物学状态,从而可以达到长期保存种质的目的[11]。
玻璃化超低温保存是将细胞或组织在冰冻前,用植物玻璃化溶液处理使细胞在-196℃下不形成冰晶而呈玻璃化状态。该方法具有需要设备简单、操作方便、重复性好等特点,为种质资源的保存提供了更为理想的途径。
研究表明,玻璃化超低温保存后,再生的植株能很好地保持其遗传稳定性。玻璃化超低温保存后木瓜再生植株在形态上,无论是叶柄的颜色、叶子的形状、雌花的大小和颜色以及果实的形状和色泽均没有差异[22];与对照相比,玻璃化超低温保存后苹果茎尖的再生苗不仅在形态上没有发生变异,同时其叶片中可溶性蛋白质含量、基因水平均没有发生变异[23]; Dioscorea floribunda玻璃化超低温保存后无论是形态水平(成熟叶片长宽比、新生芽数、节间长度等)、分子水平,还是次生代谢产物含量(薯蓣皂甙元)等方面均保持稳定[24]。本研究也显示,玻璃化超低温保存后的怀菊花再生苗在形态上没有变异,同时叶片中可溶性糖、可溶性蛋白质和叶绿素含量也没有发生变异,在形态和生理上保持了其稳定性,至于在基因水平上是否发生变异还有待进一步研究。
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