单位文秘网 2021-07-09 08:16:34 点击: 次
组织状态相对较好;各转化条件的筛选结果,农杆菌侵染浓度OD600为0.4~0.6、侵染时间15~20 min、共培养2~3 d、培养基上添加无菌滤纸、G418筛选浓度150 mg·L-1和草甘膦筛选浓度800 mg·L-1是提高转化效率的优化条件; PCR分析结果,多基因载体P5中的GUS基因成功转入籼稻明恢86。【结论】通过对培养条件的优化,可使籼稻明恢86愈伤组织的诱导愈伤率和抗性愈伤率得到显著提高。
关键词:基因;遗传转化;籼稻;明恢86
中图分类号:S 511文献标识码:A文章编号:1008-0384(2019)06-621-09
Abstract:【Objective】Conditions for simultaneous transformation of multiple genes in Indica rice, Minghui 86, were studied to facilitate the development of high yield and resistant breeds.【Method】Two multi-gene vectors designated as P5 and P8 that harbored the high-yield RRM2, drought-tolerant HS1, herbicide-resistant EPSPS, and insect-resistant Bt as well as the apoptosis-inhibiting iap and gene that promotes cell regeneration p35 were transformed to the receptor Minghui 86 using agrobacterium-based transformation methodology. The receptor, callus culture, agrobacterium concentration, infection time, co-culture, and screening concentrations of G418 and glyphosate were evaluated for the selection. 【Result】 Under same culture conditions, the recovery rate of Minghui 86 immature embryos was significantly higher with a better callus quality than that of the mature embryos. The optimal transformation conditions were determinated to be a bacterial concentration of OD600=0.4-0.6, an infection time of 15-20 m, co-culture for 2-3 d with the addition of sterile filter paper in medium, and the screening concentration of G418 at 150 mg·L-1 and of glyphosate at 800 mg·L-1. The PCR detection confirmed that GUS in the polygenic vector P5 was successfully transferred into Indica cv. Minghui 86.【Conclusion】 The optimized culture conditions afforded significantly improved callus and resistance induction rates in Minghui 86.
Key words: gene; genetic transformation;indica rice;Minghui 86
0 引言
【研究意義】水稻是世界上最重要的粮食作物之一,世界上50%以上的人口以稻米为主食。水稻主要有籼稻和粳稻两大亚种,栽培面积最大的是籼稻[1]。随着分子生物技术的发展,遗传转化技术已经成为水稻遗传改良的重要手段之一[2]。在转基因育种方面,粳稻品种已具有一套高效稳定的遗传转化体系,而籼稻品种的遗传转化体系还不稳定,其转化效率大概在10%左右[3]。因此,进行籼稻品种的多基因遗传转化体系研究,探讨其适宜的转化条件,对籼稻分子育种具有重要的现实意义。【前人研究进展】1986年Baba等[4]采用聚乙二醇(PEG)法将农杆菌与水稻原生质体融合起来,得到了一部分能够合成胭脂碱的胚性愈伤组织,使水稻转基因技术得到了发展。1994年Hiei等[5]建立了农杆菌介导的粳稻遗传转化体系,转化率高达28.6%,至此农杆菌介导的水稻转化取得了初步成功。1998年,Cheng等[6]用农杆菌介导法,将Bt的基因转入水稻,有效控制了水稻病虫害。1999年,项友斌等[7]将改良的Bt基因cryIA(b)和cryIA(c),分别转入水稻愈伤组织,获得转基因植株。随着水稻遗传转化研究的深入发展,在稳定的单基因和双基因转化体系研究的基础上,人们开始尝试多基因转化。Chen等[8]用基因枪法将14个含不同基因的质粒转化到水稻中。冯道荣等[9]将含有2~3个抗真菌基因和2个抗虫基因的多基因表达载体混合,利用基因枪法将它们共同导入到水稻胚性愈伤组织中,发现70%的转基因植株含有6~7个目的基因。目前,基因枪法虽然在多基因转化方面效果较理想,但基因枪法转化费用较高,实际应用受到一定限制。Ye等[10]利用调控前维生素 A或胚乳色素体中番茄红素合成的2个重要植物酶基因psy和crtI,以及标记基因aphⅣ构建了3个表达载体,借助LBA4404农杆菌转化水稻幼胚均获得胚乳中合成β-胡萝卜素的转基因植株,培育了备受关注的黄金水稻。【本研究切入点】在以往的转基因育种中,除了基因枪法外的大多数方法只能转化1~2个基因,对作物改良效果有限。若能在费用不是太高的情况下一次性对多个基因进行共转化,其转化效率将显著提高,不仅省时省力,还能在获得转基因材料的同时获得多个目标性状[11-12]。为此,本研究主要从多基因转化体系转化效率和转化效果的影响因素入手,分别对多基因遗传转化体系的受体材料、农杆菌浓度、侵染时间、共培养方式、G418筛选浓度和草甘膦筛选浓度等主要影响因素进行试验,探讨其适宜的转化条件。【拟解决的关键问题】本研究在实验室前期对籼稻明恢86进行多基因遗传转化的基础上,进一步对其转化条件进行优化,期望建立高效、稳定的多基因遗传转化体系,并获得含高产、抗逆、抗虫、抗病等基因的水稻新材料。
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