单位文秘网 2021-07-09 08:07:31 点击: 次
组织捣碎机打成匀浆,放入冰箱保藏备用。
1.2.2最佳提取工艺条件的筛选。
选择对有机溶剂萃取苦瓜子衣色素效果影响较大的3个因素:萃取时间(A)、萃取温度(B)、料液比(C),并以乙酸乙酯为萃取剂,以苦瓜子衣色素提取率为指标,设计正交试验。
1.2.3双水相体系的制备。
固定聚乙二醇4000质量分数为25%,不添加无机盐,以不同质量分数的硫酸铵(25%、30%、35%、40%、45%)组成双水相体系,加入6 g苦瓜子衣,pH调至7.0,4 ℃萃取4 h,测定蛋白质的分配系数及相比和萃取率。
固定硫酸铵质量分数为35%,不添加无机盐,以不同质量分数的聚乙二醇4000(25%、30%、35%、40%、45%)组成双水相体系,加入6 g苦瓜子衣,pH调至7.0,4 ℃萃取4 h,测定蛋白质的分配系数及相比和萃取率。
1.2.4苦瓜子衣蛋白提取。
分别量取100 mL 30%聚乙二醇4000溶液和100 mL 35%硫酸铵溶液于锥形瓶中,加入6 g苦瓜子衣,混匀后,调节溶液pH为7.0,4 ℃搅拌提取4 h,10 000 r/min离心20 min,得苦瓜子衣色素蛋白粗提液。用聚乙二醇6000包埋透析袋进行浓缩至1.5 mL,装入离心管中冷冻备用。
1.2.5苦瓜子衣色素蛋白的纯化。
1.2.5.1DEAE纤维素柱(10 mm×300 mm)层析纯化苦瓜子衣色素蛋白。
将苦瓜子衣色素粗蛋白样品用PBS缓冲液(pH 8.0,0.05 mol/L)溶解,使其浓度为1 mg/mL,4 ℃、10 000 r/min离心20 min,去除不溶物,并将上清液加载于DEAE纤维素柱上,用0.02 mol/L磷酸缓冲液(pH 8.0)洗柱,进行0~0.6 mol/L NaCl的梯度洗脱,以1 mL/min的流速洗涤,经紫外仪检测,收集洗脱液,4 ℃浓缩。
1.2.5.2
Sephadex G-100柱(10 mm×300 mm)层析纯化苦瓜子衣色素蛋白。
将DEAE-52柱层析中收集的蛋白洗脱液上Sephadex G-100柱,用PBS缓冲液(pH 8.0,0.05 mol/L)平衡洗脱,分管收集,流速控制在1 mL/min,每管收集1 mL,在波长280 nm处检测吸光度。
1.2.6
苦瓜子衣色素纯化蛋白的SDS-PAGE电泳。
聚丙烯酰胺凝胶浓度:分离胶12.5%,浓缩胶2.5%。加样量35 μL/槽。室温,恒流25 mA,电泳6~7 h。考马斯亮蓝(CBB-R250)染色,透射照相记录。
1.2.7
苦瓜子衣色素纯化蛋白的抗氧化试验(参考Fenton法)[6-7]。
在试管中加入0.1 mL 0.6 mmol/L的H2O2、0.1 mL 0.6 mmol/L的水杨酸溶液、0.1 mL 0.6 mmol/L FeSO4溶液,加入后立即混匀。再向其中分别加入0.1 mL苦瓜子衣色素纯化蛋白和粗蛋白溶液(浓度分别为0.5、1.0、15、2.0、30、4.0 mg/mL)混勻。以蒸馏水为参比,与试剂空白液比较。在波长510 nm处测2种蛋白不同浓度的吸光度,计算被测物对羟自由基的清除率。
羟自由基清除率=(A1-Ax)/A1×100%
式中,A1为空白对照液的吸光度;Ax为加入提取液后的吸光度。
2结果与分析
2.1最佳提取工艺条件的筛选
由表2可知,A1B3C3为最佳组合,即萃取温度为50 ℃、料液比为1〖DK〗∶40、萃取时间为30 min时,苦瓜子衣色素的提取率最高,为45.54%。此条件为苦瓜子衣色素提取的最佳工艺条件。
2.2双水相体系的制备
表3显示,当聚乙二醇4000的量固定时,一定范围内随着硫酸铵质量分数的增加,蛋白质的回收率逐渐上升;当硫酸铵质量分数大于35%时,蛋白质回
收率又逐渐下降。硫酸铵质量分数过高,不仅会破坏酶表面的水化层,使蛋白发生盐析,蛋白的萃取率下降;而且扰乱双水相系统,改变各相中成相物质的组成和相体积比[8]。综合考虑,确定硫酸铵的质量分数 35%为佳。
表4显示,当硫酸铵的量固定时,随着聚乙二醇4000质
量分数的增加,蛋白质回收率先增大后减小,并且在聚乙二醇4000质量分数为30%时,蛋白质的回收率达到最佳值。从分配理论
上解释,随着聚乙二醇4000量增加,黏度增大,阻止相间分子转移的能力增加,相界面张力亦增加。当聚乙二醇4000用量较低时,硫酸铵的盐析作用起主要作用,使蛋白质大部分分布在下相中[9]。
2.3苦瓜子衣色素蛋白的纯化
苦瓜子衣色素粗蛋白样品上DEAE阴离子交换柱,共得到2个洗脱峰。进一步纯化目的蛋白,将洗脱液继续上Sephadex G-100凝胶柱,共得到1个吸收峰(图1)。进行SDS-PAGE检测,如图2所示,电泳结果显示仅为1条带,说明其已经达到电泳纯,分子量为7410 kD。
2.4苦瓜子衣色素纯化蛋白的抗氧化作用
由表5可知,苦瓜子衣纯化蛋白和粗蛋白均具有抗氧化能力,其清除羟自由基的能力随着质量浓度的增加抗氧化性增强,但苦瓜子衣纯化蛋白在同等质量浓度下均稍弱于粗蛋白,原因可能是粗蛋白中含多种具抗氧化活性的蛋白共同产生作用。
3结论与讨论
该试验采用传统的乙酸乙酯法提取苦瓜子衣色素,确定苦瓜子衣色素提取的最佳条件。采用新兴的双水相法提取苦瓜子衣色素蛋白,为苦瓜子衣色素蛋白的提取开创新的途径。双水相法分离不同物质,系统中的聚乙二醇、硫酸铵的质量分数、pH、盐离子浓度等均不相同[10],此法减少了蛋白的流失,且特异性强,有机试剂用量少,不必进行脱盐处理,简化了试验操作。
该试验发现,苦瓜子衣色素粗蛋白和纯化蛋白具有不同程度的抗氧化能力,苦瓜子衣色素蛋白粗提液中成分复杂,可能含有多种抗氧化能力的蛋白,因此苦瓜子衣色素粗蛋白的抗氧化活性大于纯化蛋白。苦瓜子衣色素蛋白是一种良好的、无毒害、纯天然的抗氧化物质,对其进行深入研究将为大规模生产抗氧化制剂奠定坚实基础。
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