单位文秘网 2021-07-10 08:13:47 点击: 次
[摘要] 目的 通过检测赣南地区非综合性唇腭裂(NSCL/P)患者与正常人血浆内源性代谢产物的变化,探讨基于核磁共振(NMR)的代谢组学方法在临床实践中的可行性。 方法 分别收集17例NSCL/P患者和16例正常人对照组的血浆样品,测定NSCL/P患者血浆的一维1H-NMR图谱,采用主成分分析法(PCA)分析NMR数据,以鉴别NSCL/P组和正常对照组血浆中内源血浆代谢产物的变化,获得NSCL/P患者的特征代谢物。 结果 NSCL/P组和正常对照组间的血浆代谢产物存在明显差别。与正常对照组相比,NSCL/P患者血浆中的缬氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的含量升高;NSCL/P患者血浆中的丙氨酸、胆碱、磷酰胆碱等代谢物的含量降低。 结论 采用基于NMR的代谢组学技术能较好地反映赣南地区NSCL/P患者血浆的代谢变化,通过1H-NMR代谢图谱获得NSCL/P的特征代谢物,可以初步探讨NSCL/P的代谢机制,表明了该技术在临床应用中具有很大的潜能。
[关键词] 代谢组学;非综合征性唇腭裂;主成分分析;血浆
[中图分类号] R782.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701(2014)36-0059-04
Preliminary investigation on plasma of non-syndromic NSCL/P using NMR-based metabonomics in southern Jiangxi
LING Yongchang1 LIU Ruizhen2 LIU Xiang1 ZHANG Ying1 LI Niansheng1
1.Department of Stomatology, the First Affiliated Hospital of Gannan Medical College, Ganzhou 341000, China; 2.Laboratory of Anatomy, Gannan Medical College, Ganzhou 341000, China
[Abstract] Objective To study the metabolic changes in plasma of non-syndromic cleft lip and/or palate (NSCL/P) patients in southern Jiangxi and to explore the feasibility of employing nuclear magnetic resonance (NMR)-based metabonomics in clinical practice. Methods Plasma samples were collected from 17 NSCL/P patients and 16 healthy controls. 1-dimensional 1H-NMR spectroscopy and principal component analysis(PCA) was performed to analyze plasma metabolomic profile. Discriminating metabolites were identified and the metabonomic difference in plasma was examined between NSCL/P patients and the control group. Results The plasma metabolic profiling in NSCL/P patients was clearly distinct from that of healthy controls. Compared with the control group, valine, phenylalanine and tyrosine were higher in plasma of NSCLP patients, while the levels of metabolites in plasma such as alanine, choline and phosphocholine were lower. Conclusion NMR-based metabonomics approach could clearly reflect the metabolic changes of plasma in NSCL/P patients. Our study clearly demonstrated the great potential of the NMR-based metabonomics approach in elucidating the NSCL/P plasma metabolism and the feasibility of application in clinic diagnosis.
[Key words] Metabonomics; NSCL/P; PCA; Plasma
唇腭裂是常见的颌面发育畸形,其中非综合征性唇腭裂是常见的先天性畸形,它是指不伴发其他系统器官畸形,不在综合症之内唇裂合并腭裂,是一种多基因易感性疾病,有复杂的遗传特点[1,2],在致畸因素的影响下可能于胚胎发育的4~12周发生,环境因素也是此症发生的重要原因。包括孕早期吸烟、饮酒、药物、营养缺乏、病毒感染、高热[3,4]。治疗过程有一点难度,且周期较长[5]。
代谢组学作为新近发展起来的一门学科,是指对由于生理病理刺激而引起的生物体代谢产物的动态变化同时进行定性和定量分析的一门科学。主要是通过检测生物体液和组织的NMR图谱,对生命系统内小分子代谢物进行定量分析,通过模式识别和多元统计分析的方法进行系统测量、分析,将代谢物与生理病理刺激下的相关生物学事件联系起来,以确定变化发生的作用靶点,进而确定相关的特征生物标志物[6,7]。迄今,代谢组学研究中常用的分析工具是NMR,尤其是1H-NMR[8,9]。
本研究旨在运用代谢组学技术检测唇腭裂患者血浆,研究比较先天性唇腭裂患者和正常人的血浆代谢情况,找出两者间的差异,初步探讨唇腭裂患者血浆代谢的可能机制,从而为未来唇腭裂患者的早期诊断提供潜在的检测代谢物。
1 材料与方法
1.1实验仪器
本试验使用的主要仪器有:Bruker Avance DRX 600核磁共振仪(Bruker公司,德国);XYJ80-2低速离心机(江苏金坛实验仪器有限公司);MR1812高速离心机(jouan公司,法国);4 mL肝素钠抗凝管(Becton Dickinson公司,美国);F6-1冷冻干燥机(北京博康实验仪器有限公司)。
1.2血浆样本的采集
随机采取2013年7月~2014年7月在我院口腔科诊断为非综合征性唇腭裂患者的血浆(17例)。诊断为非综合征性唇腭裂的患者无单基因引起面裂的家族史,无相关致畸因子接触史,不伴发其他畸形且身体发育正常[10]。其中单纯性腭裂患者8例,唇裂并发腭裂患者9例;女12例,男5例;年龄6~18岁,平均(8±4.8)岁。并随机选择2013年在赣南医学院第一附属医院健康体检科查体的健康人17例作为正常对照组,女12例,男5例;年龄7~20岁,平均(12.0±5.1)岁。
1.3 研究方法
1.3.1 样本的采集及处理 血液样本采集前,要求研究对象空腹6 h以上。一次性静脉采血器抽取4 mL血液注入肝素钠抗凝管中,室温下1500 r/min离心15 min,然后取上清液2 mL放入去酶的EP管内,在涡旋混匀器上快速混匀1 min后于4℃、14000 r/min离心15 min。吸取二次离心后的上清液1.5 mL放入干净的EP管内,并立即放入20℃低温冰箱中保存备用。
1.3.2 NMR数据的采集 ①预处理样本:冷冻血清室温下解冻,离心后取上层血清200 μL加至5 mm的核磁管中,加入300 μL的重水(用于锁场),振荡混匀。②获取1H-NMR谱图:运用Varian 600 MHz 谱仪进行NMR 实验,1H-NMR共振频率为599.93 MHz。横向弛豫加权实验采用水峰抑制的Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)序列,弛豫延迟2.0 s,采集时间为1.5 s,谱宽12000.0 Hz,温度25℃,总回波时间100 ms,累计次数64次。对所有一维1H-NMR谱在Topspin软件(3.0,Bruker Biospin,德国)上进行相位和基线矫正后,用α-葡萄糖在低场处的双峰定标(5.23 ppm)。用AMIX软件(V3.9.11,Bruker Biospin,德国)对定标后的谱图在0.50~9.50 ppm的区域分段积分,积分区间宽为0.002 ppm。为了消除残余水峰、尿素峰以及外源信号的影响,去掉6.88~4.21 ppm 一段包含残余的水峰和尿素峰。之后,对核磁谱图进行总面积归一化处理。将数据导入SIMCA-P+软件包(11.0,Umetrics,瑞典)进行多变量分析。PCA、PLS-DA和OPLS-DA均取第一和第二两个主成分,均用得分图(Scores plot)表示。PCA结果主要观察样品整体的聚类情况以及是否存在离群点。PLS-DA和OPLS-DA采用UV方式进行标准化处理,并运用交叉验证和排列试验对模型可靠性进行验证。对通过验证的模型(P<0.05),用相关系数负载图(Loading Plot)表示出有贡献的物质及其贡献的大小(r值),颜色越暖贡献越大。通过皮尔逊相关系数的显著性差异检测(Pearson’s product-moment correlation coefficient)判定具有显著性变化的代谢物,进而对这些物质进行生物学解释。
2 结果
2.1 NSCL/P患者与正常人血浆1H-NMR代谢图谱比较
将正常对照组和NSCL/P组尿液1H-NMR指纹图谱放大6倍并进行叠加比较。波谱显示了两组样品在(δ0.5~5.5 和δ5.5~9.0)的化学位移处存在差异波峰。关键词:1,lipid脂质;2,valine缬氨酸;3,leucine亮氨酸;4,isoleucine异亮氨酸;5,3-hydroxybutyrate(3-HB)羟基丁酸;6,lactate乳酸;7,alanine丙氨酸;8,lysine赖氨酸;9,acetate醋酸;11,glutamate谷氨酸;12,pyruvate丙酮酸;13,succinate琥珀酸;14,citrate柠檬酸; 15,malate苹果酸;16,trimethylae(TMA)三甲胺盐酸盐;17,dimethylglycine(DMG)二甲基甘氨酸;18,creatine肌酸;19,choline胆碱;20,phosphorylcholine(PC)磷酸胆碱;21,glycerophosphocholine(GPC)甘油磷酰胆碱;22,trimethylamine-N-oxide(TMAO) 氧化三甲胺;23,β-glucose葡萄糖;24,α-glucose右旋糖;25,scyllo-inositol青蟹肌醇;26,glycine甘氨酸;27 urea尿素;28,histidine组氨酸;29,tyrosine酪氨酸30,phenylalanine苯丙氨酸31,formate甲酸盐,见图1。
2.2 PCA分析
为了分析各个样品之间的关系,将校正后的数据做PCA分析。PCA是可以将分散在一组变量上的代谢图谱信息集中到某几个综合指标上的统计分析方法,利用主成分分析机体代谢的变化特征。采用SIMCA-P+软件(V11.0,Umetrics AB,Umea,Sweden)对归一化后的数据进行模式识别多变量分析,PCA采用中心化换算(mean center scaling,Ctr)的数据标度换算方式。见封三图1。
2.3 PLS-DA分析
利用SIMCA-P+软件(V11.0,Umetrics AB,Umea,Sweden)对归一化后的数据进行偏最小二乘法(PLS)发现NMR 数据(X变量)和其他变量(Y变量,分组信息)之间的相关联系。偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)使用自适换算(unit variance scaling,UV)的数据标度换算方式。同时用交叉验证后得到的R2X 和Q2(分别代表模型可解释的变量和模型的可预测度)评判模型的有效性。然后,通过排列实验随机多次(n=200)改变分类变量y 的排列顺序得到相应不同的随机Q2值进一步检验模型的有效性。见封三图2。说明以模型的可解释指标R2X 和可预测指标Q2,结合排列试验检验结果共同显示,血清样本的NSCLP组和Control组所建立的模型成立。从得分图可以看出,两组数据虽然没有截然分开,但有各自的类聚关系,可以将两者区分开来,说明NSCLP组样本的代谢组出现显著性差异。
2.4 OPLS-DA分析
正交矫正处理(OPLS-DA)PLS-DA 模型,使用SIMCA-P+软件(V11.0, Umetrics AB, Umea, Sweden)进行正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA),最大化地凸显模型内部不同组别间的差异。OPLS-DA 同时使用自适换算(unit variance scaling,UV)的数据标度换算方式。见封三图3。
2.5组间血浆差异代谢物统计
通过对OPLS-DA 的分析,分析不同组间血浆各代谢物相应的相关系数,进一步归纳有统计学意义的代谢物。在相关系数图中,将每一个变量的loading 值与其标准偏差的平方根值相乘后进行数据的回溯转换。然后与相应的相关系数临界值表进行比对,统计引起组间差异的代谢物。与正常对照组相比,NSCL/P患者血浆中的缬氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的含量升高;从表1可知,NSCL/P患者血浆中的丙氨酸、胆碱、磷酰胆碱等代谢物的含量降低。
表1 两组血浆中代谢物的NMR数据的OPLS-DA系数(相关系数│r│> 0.468被认为有统计学差异)
3 讨论
先天性唇腭裂严重危害着口腔颌面器官的形态及功能,不仅影响出生人口素质,亦给患者及相关家庭造成身心负担。该疾病从遗传学上可分为综合征性唇腭裂与非综合征性唇腭裂两种,其中更为多见的是非综合征性唇腭裂。而非综合征性唇腭裂的发病原因极其复杂,有研究表明可能与遗传和环境因素[11-13]密切相关,但截至目前为止,尚未找到明确的直接发病因素。
一般来说,人体血浆1H-NMR指纹图谱中的共振吸收峰所对应的化合物与人体血浆中所含生物有机成分是相同的,但是不同疾病患者血液中生物有机分子由于病变会发生不同程度的改变,从而引起不同疾病的患者和正常人的血浆中所含的生物有机分子在某种程度上的不同,反映在1H-NMR上也是有所不同的。
本研究运用代谢组学[14]对比分析了17例非综合征性唇腭裂患者和17例正常人的血浆样本,测定两者的1H-NMR 图谱,将正常人对照组和NSCL/P病患组尿液1H-NMR指纹图谱放大6倍并进行叠加比较。波谱显示了两组样品在(δ0.5~5.5 和δ5.5~9.0)的化学位移处存在差异波峰。接下来通过对OPLS-DA的分析,分析不同组间血浆各代谢物相应的相关系数,统计引起组间差异的代谢物。结果表明,非综合征性唇腭裂患者和正常人对照组间的血浆代谢产物存在明显差异,这种差异主要是因为某些氨基酸与胆碱存在异常代谢。如非综合征性唇腭裂患者血浆中的缬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的含量较正常人有所升高。其中,缬氨酸和苯丙氨酸都为必需氨基酸,缬氨酸通过作用于乳腺、黄体及卵巢,来维持神经系统功能的正常运行。苯丙氨酸的主要作用是确保中枢神经系统运作正常。同时与正常健康人相比,非综合性唇腭裂患者血浆中的丙氨酸、胆碱、磷酰胆碱等代谢物的含量降低。丙氨酸虽为非必须氨基酸,但是起着重要作用。可以帮助身体将葡萄糖转变为能量,同时还可以协助肝脏处理和清除体内各种不同毒素。这些功能便于给身体提供养料。此外,它还有助于保持血液中葡萄糖的健康水平。胆碱是一种强有机碱,是卵磷脂的组成成分,也存在于神经鞘磷脂之中,是机体可变甲基的一个来源而作用于合成甲基的产物,同时又是乙酰胆碱的前体。能够促进脑发育和提高记忆能力,介导信息传递,调控细胞凋亡。这些代谢物的异常,会引起一些相关疾病的发生。
本研究表明,运用代谢组学技术可以早期筛查某种疾病并探讨其代谢机制,从而有可能推测其潜在的发病原因,从而为以后的临床应用提供理论支持。但我们目前的研究仅仅限于技术层面的一些探索,初步得到一些结果。在接下来的研究中,我们准备拓展实验:①扩大样本量,使其更具有统计学意义;②监控患者12 h前摄入食物的种类、数量等,尽量减少实验误差[15]。由于目前的研究趋势是将代谢组学与基因组学、转录组学和蛋白质组学技术[16]整合起来,因为基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学分别在基因、转录、蛋白质和代谢产物水平上检测和鉴别各种分子并研究其生物学功能[17]。在未来的研究中,我们将会从多方面、多角度的深入进行非综合征性唇腭裂患者的血浆研究。
[参考文献]
[1] 代礼,缪蕾,周光萱,等. 1996~2000年中国围产儿腭裂畸形发生状况分析[J]. 华西口腔医学杂志,2004,11(1):35-37.
[2] 王丽君,黄金龙,万伟东. 非综合征性唇腭裂的遗传因素和环境因素研究进展[J]. 国外医学·遗传学分册,2005, 28(2):102-104.
[3] 陈曼丽,凌彬,林兆全. 非综合征性唇腭裂基因研究进展[J]. 中华老年口腔医学杂志,2009,7(3):188-191.
[4] 宋丛笑,张严. 唇腭裂发生因素分析[J]. 中国临床康复,2003,7(17):2495.
[5] 李攻非,柳春明. 唇腭裂患者上颌骨矫形治疗[J]. 口腔颌面修复学杂志,2001,2(2):58-60.
[6] Nicholson J K,Lindon J C,Holmes E. Metabonomics:Understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J]. Xenobiotica,1999,29(11):1181-1189.
[7] Lindon J C,Nicholson J K,Holmes E,et al. Contemporary issues in toxicology the role of metabonomics in toxicology and its evaluation by the COMET project[J]. Toxicol Appl Pharmacol,2003,187(3):137-146.
[8] 杨军,宋硕林,Jose Castro Perez,等. 代谢组学及其应用[J].生物工程学报,2005,25(1):1-5.
[9] 陈雅竹,刘建国,白国辉,等. 代谢组学在口腔医学研究中的应用进展[J]. 中华临床医师杂志,2013,7(14):6646-6649.
[10] 石冰. 唇腭裂修复外科学[M]. 成都:四川大学出版社,2004:35.
[11] 唐坤伦,马瑞,张健. 96例非综合征性唇腭裂发病因素的统计学分析[J]. 口腔颌面修复学杂志,2013,14(3):179-182.
[12] 丁艳,刘长云,王永芹,等. 非综合征性唇腭裂高危因素的条件Logistic回归分析[J]. 中华妇幼临床医学杂志,2008,4(6):533-536.
[13] 何苇,宋庆高. 造成唇腭裂发病相关因素分析[J]. 口腔颌面外科杂志,2007,17(3):259-261.
[14] 洪毅,谈冶雄,王红阳. 代谢组学——肿瘤学研究的重要技术平台[J]. 中国肿瘤生物治疗杂志,2007,14(6):585-588.
[15] 宋具昆,周京琳,罗洪,等. 非综合征性唇腭裂患者血浆代谢组学的初步研究[J]. 华西口腔医学杂志,2009, 27(2):147-149.
[16] Kitano H. Systems biology:a brief overview[J]. Science,2002,295(5560):1662-1664.
[17] German J B,Bauman D E,Burrin D G,et al. Metabolomics in the opening decade of the 21st century:Building the roads to individualized health[J]. J Nutr,2004,134(10):2729-2732.
(收稿日期:2014-10-31)
(责任编辑:单位文秘网) )地址:https://www.kgf8887.com/show-182-63303-1.html
下一篇:高压氧结合青蒿素治疗癌症
版权声明:
本站由单位文秘网原创策划制作,欢迎订阅或转载,但请注明出处。违者必究。单位文秘网独家运营 版权所有 未经许可不得转载使用