单位文秘网 2021-08-18 08:56:37 点击: 次
摘要:从造纸污泥中分离到一株芽孢杆菌ZA-05,该菌可产生内切β-1,4-葡聚糖酶酶活性,且在碱性条件下酶活较高,经生理生化和分子生物学鉴定,该菌株为淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens);根据GenBank登录的内切-β-1,4-葡聚糖酶基因(DQ782954.1,M28332.1,AY859492.1)的同源性序列,利用PCR方法克隆到该菌株的功能基因,并对其进行测序。测序结果显示其全长为1 500 bp,推测其含499个氨基酸。
关键词:淀粉液化芽孢杆菌;分离鉴定;碱性纤维素酶;基因克隆
中图分类号:Q939.124文献标识码:A文章编号:0439-8114(2011)18-3859-04
Isolation and Functional Gene Cloning of Alkaline Glucanase Producing Bacillus
Strain ZA-05
WEI Yan-li,LI Hong-mei,LI Ji-shun,HU Jin-dong,YANG He-tong
(Biotechnology Center of Shandong Academy of Sciences/Key Laboratory of Applied Microbiology of Shandong Province, Jinan 250014,China)
Abstract: An alkaline glucanase producing strain ZA-05 which had the enzyme activity of endo-β-1, 4-glucanase was isolated from paper mill sludge by Congo-red staining method. It was identified as Bacillus amyloliquefaciens based on its morphological characters and 16S rDNA sequence. According to the homologous sequence of endo-β-1, 4-glucanase gene(GenBank No. DQ782954.1, M28332.1, AY859492.1), an alkali-tolerant glucanase gene was amplified by PCR and then sequenced. Thefull length of this alkali-tolerant glucanase gene was 1 500 bp and presumably encoded 499 amino acids.
Key words: Bacillus amyloliquefaciens; isolation and identify; alkaline glucanase; DNA cloning
纤维素酶是能将纤维素水解成还原糖的一类酶系的总称,主要包括内切-β-1,4-葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanase,EC 3.2.1.4,EG)、纤维二糖水解酶(exo-1,4-β-D-glucanase,EC 3.2.1.91,CBH)和β-葡萄糖苷酶(β-1,4-glucosidase,EC3.2.1.21,BG);按适宜pH值不同,又可分为酸性纤维素酶(最适pH为4.5~5.5)、中性纤维素酶(最适pH为6.0~8.0)和碱性纤维素酶(最适pH为8.0~11.0)。
碱性纤维素酶主要由在碱性环境中生长的芽孢杆菌和链霉菌产生。其最适pH处于碱性范围,具有水解细小织物纤维的能力,可以作为洗涤用酶。碱性纤维素酶加入到洗涤剂中不仅可以增强洗涤效果,而且对衣物还具有柔软、增艳的作用,其发现和应用被称为洗涤剂工业的一次技术革命[1]。可生产碱性纤维素酶的微生物种类很多,但用于工业化生产的主要是芽孢杆菌的几个种,如地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和嗜碱性芽孢杆菌等。
该研究从造纸污泥中分离到一株产碱性纤维素酶的淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),并对其功能基因进行了克隆。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1主要试剂PCR试剂、限制性内切酶、氨苄青霉素(Amp)、核酸分子量标准物、DNA凝胶回收试剂盒、T4 DNA连接酶和X-gal、IPTG、测序载体pMD18-T等分别购自上海生工生物工程技术服务有限公司和宝生物工程(大连)有限公司等公司。
1.1.2主要培养基羧甲基纤维素培养基:羧甲基纤维素1 g,K2HPO4 0.187 g,柠檬酸0.125 g,琼脂1 g;其他生理生化鉴定培养基配方参照文献[2]。
1.2方法
1.2.1样品采集污泥土样(pH 为9.5~10.5)采自山东威海某造纸厂污水排放口处。
1.2.2菌株分离取1 g土样放入装有9 mL无菌水的试管中,混匀后于80 ℃水浴加热20 min,取1 mL进行梯度稀释,分别取稀释到10-4、10-5、10-6的稀释液涂布NA培养基平板,30 ℃培养24 h。挑取不同形态的单菌落转接至NA培养基斜面上,30 ℃恒温培养24 h,置于4 ℃冰箱保存备用。
1.2.3菌株活性检测内切-β-1,4-葡聚糖酶酶活性的测定参考文献[3],将纯化后的菌株点接在羧甲基纤维素培养基平板上,30 ℃培养约30 h后,用1 mg/mL的刚果红溶液染色20 min,倒去染色液并用1 mol/L的NaCl溶液冲洗,去掉表面附着的刚果红,观察是否出现透明水解圈。
1.2.4初始pH对菌株内切-β-1,4-葡聚糖酶酶活性的影响配制pH分别为4、5、6、7、8、9、10、11的羧甲基纤维素培养基,点接纯化后的菌株,30 ℃培养30 h,用1 mg/mL的刚果红溶液染色20 min,倒去染色液并用1 mol/L的NaCl溶液脱色,测量菌落的透明圈直径,作为纤维素酶的相对活性。
1.2.5菌株的生理生化鉴定生理生化试验的选择主要根据《常见细菌系统鉴定手册》中相应属、种鉴定有关的内容进行。共选取了V.P.试验、硝酸盐还原、吲哚试验、淀粉水解、过氧化氢酶、糖发酵、柠檬酸盐、甲基红、苯丙氨酸脱氨酶、纤维素分解、脲酶、丙二酸盐、明胶液化、精氨酸脱羧酶、耐盐试验等试验,具体方法参照文献[2]。
1.2.6菌株的分子鉴定细菌基因组DNA的提取与纯化参照文献[4]。以菌株的基因组DNA为模板,16S rDNA通用引物A(5′-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3′)和B(5′-TAC GGC TAC CTT GTT ACG-3′)进行扩增。扩增条件:94℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,51 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,30个循环;最后72 ℃延伸10 min。PCR产物由上海生工生物技术有限公司测序,利用BLAST软件将16S rDNA序列与GenBank中已测定的原核生物16S rDNA序列进行比较,构建系统进化树。
1.2.7内切-β-1,4葡聚糖酶编码基因的克隆根据GenBank登录的内切-β-1,4葡聚糖酶基因(DQ782954.1,M28332.1,AY859492.1),设计内切-β-1,4葡聚糖酶基因ORF的PCR引物:eglF(5′- ATG AAA CGG TCA ATC TCT A-3′)和eglR(5′- CTA ATT TGG TTC TGT TCC CCA-3′),以菌株ZA-05基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应程序为95 ℃预变性5 min;94 ℃变性40 s,53 ℃退火50 s,72 ℃延伸1 min 30 s,30个循环;72 ℃延伸10 min。
1.2.8内切-β-1,4葡聚糖酶基因序列测定和分析将PCR产物纯化后与pMD18-T载体连接,转化E. coli DH5α感受态细胞,采用蓝白斑筛选法筛选转化子,摇瓶菌培养后提质粒酶切鉴定,选取阳性转化子送上海生工生物技术有限公司进行测序。测序结果用DNAMAN软件分析,将所得序列通过NCBI的BLAST进行序列相似性分析。
2结果与分析
2.1菌株分离及活性鉴定
称取1 g造纸厂碱性污泥样品,用无菌水梯度稀释后,涂布于NA培养基平板上,培养后共获得9株不同形态的单菌落,点接在羧甲基纤维素培养基平板上,37℃培养后,用刚果红溶液染色,获得1株透明圈较大的菌株ZA-05,如图1。透明圈的大小在一定程度上反应了菌株产酶能力的强弱。
2.2pH对菌株内切β-1,4-葡聚糖酶酶活性的影响
菌株ZA-05在不同pH羧甲基纤维素培养基平板上表现的水解圈的大小也不同。其在pH为4和5的羧甲基纤维素培养基平板上几乎不能生长,没有表现出任何酶解活性;随着pH的升高,ZA-05的活性也随着升高,当pH为10时活性最大,水解圈直径达到2.37 cm。
2.3菌株ZA-05的鉴定
2.3.1菌株ZA-05的生理生化鉴定菌体呈短杆状,染色均匀,具运动性,兼性厌氧,可形成内生芽孢,芽孢囊膨大,呈椭圆形,游离芽孢表面着色弱。在LB培养基上呈白色不透明菌落,表面粗糙,菌落边缘不规则。生理生化试验结果见表1。从表1中可知,菌株ZA-05接触酶、硝酸盐还原、淀粉水解、D-葡萄糖发酵、明胶水解和酪素水解等为阳性;吲哚产生试验、V.P.试验、甲基红试验、卵磷脂酶、H2S产气试验等为阴性,与淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)一致。
2.3.2菌株ZA-05的16S rDNA序列分析鉴定利用通用引物从ZA-05基因组中扩增出约1 500 bp的片段,序列测定后与GenBank中的序列进行比对,将相似性较高的10个菌株构建系统进化树,结果如图3所示。菌株ZA-05的16S rDNA序列与芽孢杆菌属的淀粉液化芽孢杆菌[Bacillus amyloliquefaciens(EU373387)]相似性为99.26%,与枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis(AB501113)]相似性为99.34%。结合菌株ZA-05的生理生化特性和16S rDNA序列相似性,对照《常见细菌系统鉴定手册》,鉴定菌株ZA-05属于淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
2.4内切-β-1,4-葡聚糖酶编码基因的克隆
以菌株ZA-05基因组为模板,利用引物eglF/eglR进行PCR扩增(图4)。结果表明扩增得到的片段位于1 000~2 000 bp处,与预期目的片段1 500 bp大小基本相符。将PCR扩增产物回收并连接到pMD18-T载体上,然后转化Top10感受态细胞,在含有100 mg/L Amp的LB平板上筛选阳性转化子,然后进一步通过PCR和酶切鉴定检测其中的阳性克隆,并进行测序。
2.5菌株ZA-05内切-β-1,4-葡聚糖酶编码基因的序列分析
经测序得到的内切-β-1,4-葡聚糖酶基因(egl)序列如图5。该基因片段含有一个具有1 500个核苷酸的开放阅读框架,在GenBank中进行序列比较,该序列同淀粉液化芽孢杆菌PSM 3.1的eglII基因(GU390463)核苷酸序列同源性达到97.60%。共编码氨基酸499个,计算的理论分子量约55kDa,其序列同已发表的纤维素酶氨基酸序列(CAE11243.1)同源性为96.19%。
3讨论
目前研究的纤维素酶产生菌一般是木霉(Trichoderma)和曲霉(Aspergillus)等,产生的纤维素酶通常为酸性酶,最适pH为3~5,在碱性环境下无活性或活性很低[5,6]。该研究成功分离到一株碱性纤维素降解菌ZA-05,经鉴定为淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。在碱性条件下,菌株ZA-05仍能继续生长并表现出较强的内切-β-1,4-葡聚糖酶酶活性。淀粉液化芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌,内含很多相同或相似的基因,仅从同源性上很难精确确定它的分类地位。但是这两个菌种某些相同或相似基因的排列顺序不同,可以利用这一差别通过同时鉴定多个基因来区分这两个菌种[7]。该研究分离的ZA-05菌株16s rDNA序列与枯草芽孢杆菌(AB501113)相似性达到99.34%,结合生理生化测定结果,鉴定其为淀粉液化芽孢杆菌。碱性纤维素酶必须具有下列特性才能作为洗涤用酶:在碱性条件下具有较高的活性,酶催化反应的最适pH最好大于9.0;可以耐受洗涤剂中的表面活性剂如SDS、EDTA等;热稳定性好,至少能在50℃保温30 min后活性不发生显著的变化。该研究分离获得的菌株ZA-05在pH为10.0的条件下内切-β-1,4-葡聚糖酶活性达到最高,可满足工业生产的条件之一。该研究通过提取菌株细胞总DNA,进行内切-β-1,4-葡聚糖酶基因PCR扩增和序列测定,可为淀粉液化芽孢杆菌内切-β-1,4-葡聚糖酶基因高效表达载体的构建以及最终降低内切-β-1,4-葡聚糖酶的生产成本提供基础材料和科学依据。
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