单位文秘网 2021-08-10 08:13:08 点击: 次
【摘要】:目前微生物制药作为一种技术被人们渐渐重视。微生物也在很多制药中起了关键性的作用,不仅节约了成本、还提高了效率。例如紫杉醇:紫杉醇是细胞有丝分裂抑制剂,被用于癌症治疗(主要是卵巢癌和乳腺癌)。原始得到紫杉醇的方法就是从红豆杉科植物红豆杉的干燥根、枝叶以及树皮中提取,因此给红豆杉带来了灭顶之灾。使用微生物发酵法生产紫杉醇就解决了这个历史的难题。
【关键词】:微生物制药;紫杉醇;红豆杉;微生物发酵法
目前微生物制药作为微生物学一个比较热门的分支被人们所熟知。微生物制药就是微生物在其生命活动过程中产生的,能以极低浓度抑制或影响其他生物机能的低分子量代谢物。微生物制药利用微生物技术,通过高度工程化的新型综合技术,以利用微生物反应过程为基础,依赖于微生物机体在反应器内的生长繁殖及代谢过程来合成一定产物,通过分离纯化技术进行提取精制,并最终制剂成型来实现药物产品的生产。
1.紫杉醇的简介
紫杉醇是美国北卡罗莱纳州三角研究所的Wall博士和Wani博士于1967年发现的。之后,他们又从太平洋红豆杉中分离出了这种化合物并发现它具有广泛的抗恶性肿瘤作用。因为通过Zemplen醇解作用紫杉醇可被分解成可结晶的两部分,在1970年这两位三角研究所的科学家通过X射线衍射分析并测定了其结构,并在1971年发表了这一研究成果。
1.1紫杉醇的物理化学性质
化学名称 : 5β,20-环氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4,10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[(2’R,3’S)-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯] [1]
分子式 : C47H51NO14
分子量 : 853.92
物理性質 : 白色结晶体粉末。无臭,无味。不溶于水,易溶于氯仿、丙酮等有机溶剂。
医学用途:被用于癌症治疗(主要是卵巢癌和乳腺癌)。
1.2药理作用
真核细胞的一种组成成分是微管。在一般状态下,微管和微管蛋白二聚体之间有一种微妙的动态平衡。紫杉醇可以使这二者之间失去平衡,促进和诱导微管蛋白聚合,使微管稳定。这一系列动作导致细胞在进行有丝分裂时不能形成纺锤体和纺锤丝,抑制了细胞分裂和增殖,从而对抗肿瘤起到作用。
体外研究表明,紫杉醇浓度依赖性的、可逆性地结合在微管上,尤其是结合到N端微管蛋白的P亚基上,这一作用使聚合所需的微管蛋白的浓度降低了,使动态平衡向着微管装配的方向移动,增加微管聚合的速率和产量。紫杉醇诱导形成的微管较短,并且比不用紫杉醇时正常形成的微管屈曲性约大十倍。紫杉醇以1:1的比例结合到微管上,表明药物在微管上只有一个结合部位。另外,紫杉醇抑制有丝分裂所必需的微管网的正常动态再生,防止正常的有丝分裂纺锤体的形成,导致染色体的断裂,并抑制细胞的复制,可阻断细胞于细胞周期G2和M期,使癌细胞复制受阻断而死亡。
1.3来源
来源:红豆杉科植物红豆杉的干燥根、枝叶以及树皮。
如果单纯以红豆杉作为提取紫杉醇的原料的话,每提取一公斤的紫杉醇就需要活剥10吨树皮[2]。而且红豆杉的生长十分缓慢,差不多上百年才能成材,我国曾在20世纪90年代大肆砍伐红豆杉,使野生红豆杉差不多灭绝。然而红豆杉作为一种再生时间较长的植物,其总又量是非常有限的。因此,采用其他方式代替是非常重要的。
2.紫杉醇制取方法
2.1天然萃取法
将大量的原料投入提取罐内,再加甲醇浸提,循环浸提完成后,将浸提液排入浸提液储罐中,经蒸汽吹渣、浓缩等工艺后进行萃取。再次浓缩后蒸发干燥,取出产品,凉干,敲碎,经检验合格后即成为紫杉醇浸膏,用铁桶封装,入库阴凉保存。但是需要大批量的原料,对珍惜木材红豆杉的伤害大。
2.2人工合成法
紫杉醇的分子式为:C47H51NO14是萜类环状结构的天然次生代谢物。主要由紫杉烷环和侧链组成。研究其生物合成,对于人为定向的提高合成效率及克隆组合,形成关键的酶的基因,提高紫杉醇的产量意义重大。但是目前还没有找到一些起关键作用的酶。
2.3半人工合成法
从红豆杉植物中分离得到的10---去乙酰浆果赤霉素Ⅲ (巴卡亭Ⅲ),显然活性低于紫杉醇,但可以从红豆杉针叶中提取。该物质经过四步化学过程可合成紫杉醇。为解决紫杉醇新来源途径,取得重大进展。以NICOLAOU博士为首的美国研究小组在1994年报道通过化学方法全合成紫杉醇的结果。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破,目前还不具备应用价值。
2.4微生物发酵法
STTERLE等从短叶红豆杉韧皮部分, 分离得到一种寄生真菌(taxo myces an dreanae).可以在特定的培养基中产生紫杉醇及相关烃合物。为紫杉醇的制备开辟了一条新的道路。
3.实验室微生物发酵法制紫杉醇的具体流程
实验材料:红豆杉树皮
实验步骤:
3.1内生真菌的分离
3.1.1对植物组织表面进行消毒,以控制其表面真菌的生长,使内生菌得以分离。其分离方法是先用水冲洗以剪碎的植物材料,然后在75%乙醇中浸泡3min后,最后用无菌水冲洗。
3.1.2分离所用的培养基为PDA培养基。为了防止细菌污染可在培养基中加抗菌素,如链霉素、四环素等。恒温箱中28℃培养3-4d后观察。(在分离内生真菌时常添加一些宿主植物的提取液,以满足内生真菌的一些特殊的营养需求)
3.2内生真菌纯化、鉴定与保存
待培养基上初步长出菌落后,选择长势较好的菌落,挑取菌丝到PAD平板上纯化,根据经典形态学方法鉴定菌种。纯化的菌株在PAD斜面4℃下保存、备用。
3.3发酵培养(关键步骤)
从PAD平板上切取5mm×5mm小块菌落,接种至装有150ml液体培养基的500ml三角瓶中,于28℃,100r/min搖床上振荡培养10-14d.
3.4发酵产物的处理
紫杉醇的提取、纯化、含量测定。常用的有机溶剂:甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、 乙酸乙酯等。
提取原则:能够充分萃取出发酵液和菌丝中的紫杉醇。
4.优劣分析
4.1优势
(1)内生菌存活繁殖能力强:内生真菌可以在简单的培养基上得到良好生长
(2)发酵产物多:产生大量发酵产物
(3)发酵周期短:一般在两周左右
(4)可操控性强:可以在生物反应器中人为控制各种参数
(5)菌种性能选择性强:可以通过诱变育种等手段来提高菌种性能
4.2劣势
(1)缺乏良好的合适发酵的工业菌株。
(2)由于发酵条件的限制,单位培养液中紫杉醇的含量低。
(3)目前依然停留在实验室阶段,还没有用于工业制药。
5.近期突破及期望
通过研究还发现:根是除树皮外紫杉醇含量最高的器官。人们利用发根农杆菌(agrobac terium rhizogenes )浸然红豆杉植物外植体诱导生根。这一办法不需外援激素,发根生长迅速,遗传性状稳定而受到重视。如能把寻找合成紫杉醇或其类似衍生物,从微生物合成途径中,定向得到关键酶和克隆红豆杉相关基因结合起来,可使这一方法得到突破。
参考文献:
[1]林福呈,刘小红,王洪凯.等;紫杉醇及其产生菌的研究现状与展望;《微生物学报》, 2003,43(4):534-538.
[2]李志良,骆雪兰.等;从中国红豆杉细胞培养物中分离鉴定紫杉醇[J];天然产物研究与开发;2003年05期.
[3]周东坡,平文祥,孙剑秋.等;紫杉醇产生菌分离的研究;《微生物学杂志》 , 2001,21(1):18-19.
[4]王建锋,吕华鹰,苏文金.植物内生真菌产紫杉醇的研究;《微生物学通报》 , 2000,27(1):58-60.
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