单位文秘网 2021-07-29 08:19:28 点击: 次
组织裂解液处理,卵壳有破损,但虫卵的卵壳内其余结构仍然保存完好(图2C)。这说明高速离心可以用于虫卵的分离操作。
2.3简易浓缩纯化方案
①挑去约0.05 g粪便放入2 ml离心管中,加500 μl饱和盐水,破碎粪便并与饱和盐水混匀。②静置10 min后吸取少量上清稀释后镜检计数,计数后把计数板上液体回收并用饱和盐水冲洗计数板2~3次。冲洗液回收到新离心管中,补加饱和盐水至液面凸出离心管口,小心吸取上表层液,放入新的2 ml离心管A;③在原离心管中补加饱和盐水至1 500 μl,4 000 r/min离心10 min。然后,缓慢补加饱和盐水至液面凸出离心管口,小心吸取表层上清约100 μl放入离心管A,重复操作1次。④在离心管A中的上清液中,加入1 ml 5%的福尔马林混匀,静置过夜。⑤10 000 r/min离心5 min,小心吸去上层上清液约1 ml。重新加入1 ml灭菌蒸馏水混匀,10 000 r/min离心5 min,吸去大部分上清液。⑥余液约100 μl,加入1 ml灭菌蒸馏水混匀,10 000 r/min离心,弃上清,沉淀用100 μl 的生理盐水重悬,4 ℃或更低温度下保存备用。
2.4浓缩纯化效果
对浓缩纯化过程中的上清和沉淀混悬液镜检见图3,浓缩纯化的回收率见表1。微量粪便样本漂浮处理,较大量粪便处理的视野中杂质量相对较少,虫卵形态相对清晰;经过初次高速离心后的成点重悬液中,仍然有一定量的杂质;完成浓缩纯化操作后的样本,视野中几乎看不到杂质的存在,但也可以注意到虫卵量有减少迹象,2个样本的回收率分别为52.66%和38.90%,较常规漂浮法回收效果有明显提高。
3讨论
3.1与饱和蔗糖漂浮法的比较
饱和蔗糖液的比重128,液体粘稠度很大,漂浮前必须经过过滤处理和长时间静置,如果短时间内处理,必将增加漂浮层中的杂质含量。饱和盐水的比重为1.17~1.20,与饱和硫酸锌比重(118)接近,明显减少了漂浮层的杂质成分,这可能是因为蛔虫卵比重(1.16)与饱和盐水比重相近有关。但是,蛔虫卵的比重有变化,饱和盐水的比重也随环境温度的不同而不同,可能造成不同研究中的漂效果不一致。在对吸取表层液的剩余漂浮液镜检中发现偶有虫卵存在,提示比重的不稳定可能是该研究中的部分虫卵丢失的原因之一,因此选择
比重略高于虫卵比重的漂浮液可能会比饱和盐水更适合。
3.2与密度梯度离心技术的比较
密度梯度离心是分离技术中效果最为理想的方法之一,从简单的处理和设备的要求方面考虑,密度梯度离心所需条件相对较高。为了简化条件和技术难度,采用了通过饱和盐水、5%福尔马林和灭菌蒸馏水轮换的方式替代密度梯度,并用不同的离心速度加速这种替代的密度梯度作用,研究表明此方式确实提高了分离的实际效果,也简化了大量操作的手续。
3.3高速离心对虫卵的影响
常规的细胞离心速度以低速为主,差异大多因使用的介质和离心机的不同而不同。相同介质中离心速度过高,细胞损伤程度越大。寄生虫的卵细胞外层多包有较厚的一层蛋白膜,这是保护其在各种环境中存活的方式。因此,利用虫卵分离蛋白或核酸时,破碎虫卵往往需要采用液氮冻融、蛋白酶K消化以及超声裂解等相结合的方式。在另一研究中,将虫卵裂解后经12 000 r/min离心5 min的沉淀涂片镜检,可见有较多的虫卵还未被彻底裂解,这是笔者采用10 000 r/min的离心转速对虫卵的破坏程度不大的证据,最终的纯化结果也说明了这一点。
3.4虫卵自身特性对纯化浓缩的影响
为了不浪费虫卵液,镜检均直接观察液滴,不加盖盖玻片。镜头下面的虫卵多集中在液面最上端,回收液滴后镜检载玻片可看到仍有许多虫卵分散残留,需清洗几次才能全部回收,与N. Cardillo的浓缩方法相一致。这个现象一方面说明常规漂浮中虫卵大量丢失的原因之一,另一方面也提示采用吸取突出离心管口的表层液面的方法,是充分回收虫卵的关键。如果结合选择合适的漂浮介质,漂浮效果将更加明显。
3.5改良方法的推广
构建和检验方法的2个样本中Qf1的虫卵含量很高,而Qf2的虫卵含量比较低,严格按照方法的步骤操作,Qf2的回收效果并不理想。因此,在遇到这种情况时建议增加粪便的用量,静置时间延长至3 h以上,同时减少低速离心的次数,而增加收集凸起上层液的次数,同时结合显微镜检来确定虫卵收集程度。笔者所建立的方法是针对微量粪便样本,方法中的关键技术同样适用于大量粪便的操作,如可选取容量大但开口相对小的容器漂浮虫卵,保证液面凸出瓶口即可。
犬类动物粪便的杂质颗粒较细小,而草食类动物粪便多有未消化的植物纤维,这2种不同的粪便的前期处理应有差别。该研究中省略了用蒸馏水混悬沉淀和粗筛过滤,正是基于此。对于草食类动物粪便,可在初步了解虫卵大小的前提下,经过适合孔径筛子过滤后可以按照此方法进行相应虫卵的纯化浓缩。
43卷21期繁 萍等粪便中犬弓首蛔虫卵饱和盐水卵漂浮法的改良研究
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