单位文秘网 2021-07-10 08:18:08 点击: 次
摘 要:从小立碗藓(Physcomitrella patens)中克隆了细胞色素P450 CYP51基因PpCYP51G1的全长编码序列,编码区长1 509 bp,预测编码488个氨基酸,蛋白二级结构含有自由卷曲、伸展片段和α-螺旋,N端含有一个跨膜区域。构建了PpCYP51G1的功能缺失载体,并利用PEG介导的原生质体转化技术获得该基因的功能缺失转化体;同时,构建了PpCYP51G1-GFP融合蛋白载体,亚细胞定位结果表明,PpCYP51G1定位在内质网中。
关键词:小立碗藓;细胞色素P450;CYP51;克隆;转化载体构建
中图分类号:Q781 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2013)10-0001-07
CYP51为甾醇14α-去甲基化酶(又称P45014DM),被视为最古老的细胞色素P450家族成员[1],是细胞色素P450家族中唯一一个在真菌、植物和动物界都具有保守功能的成员[2]。真菌CYP51是真菌麦角甾醇合成过程的关键酶,抑制其活性将会阻碍麦角甾醇的合成,破坏细胞膜的结构和功能,最终导致真菌死亡。目前农业上CYP51抑制剂(14α-demethylation inhibitors,DMIs)类杀菌剂即是通过抑制真菌CYP51的活性发挥杀菌抑菌作用[3]。植物CYP51不仅参与植物体的基础代谢,还参与植物体的次生代谢,主要表现在次生代谢物质的合成及降解化学药物毒性两方面,其催化的代谢途径可产生一些重要次生代谢物, 提高植物抵抗病虫害及逆境胁迫的能力[4]。因此,研究CYP51对于研究细胞色素P450的结构、功能和进化具有重要意义。
小立碗藓(Physcomitrella patens)是目前发现的唯一具有高频率同源重组的植物[5]。同源重组是基因打靶的技术核心。Kammerer[6]和Cove[7]等首先在小立碗藓中实现了基因同源重组。随后Schaefer等[8,9]进一步证实小立碗藓基因打靶效率高达90%,与酵母基因打靶频率(95%)相当,这是高等植物中通过同源重组进行精确基因打靶的先例。目前,基因打靶技术已成为研究小立碗藓基因功能的有效工具[10~13]。由于生活周期短、易于培养、转基因植株易于分析以及核基因组易于和外源DNA发生同源重组等特点,小立碗藓已成为重要的植物分子生物学研究材料。本试验克隆了小立碗藓细胞色素P450 CYP51基因PpCYP51G1,并试图利用其高频率同源重组特性获得该基因的功能缺失突变体并通过亚细胞定位研究其功能。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
小立碗藓Gransden品系Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G由Ralf Reski 教授惠赠。
试验所用试剂:pCAMBIA-1301载体、连有GFP的PJIT163质粒由本实验室保存;大肠杆菌菌种(DH5α)、BioFlux胶回收试剂盒(3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit)购自山东济南朋远公司;Taq 酶、Ex Taq酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶、dNTP购自TaKaRa公司;pGEM-T easy vector System购自美国Promega公司;引物由北京博尚生物技术有限公司合成;Trizol购自Invitrogen公司;反转录试剂盒(First-Strand cDNA Synthesis Kit)购自上海申能博彩生物科技有限公司;测序由山东省农业科学院高新技术研究中心测序室完成。
1.2 试验方法
1.2.1 PpCYP51G1全长cDNA编码序列的克隆 采用Trizol法提取小立碗藓原丝体总RNA,利用反转录试剂盒(First-Strand cDNA Synthesis Kit)反转录合成cDNA第一条链。以小立碗藓反转录产物为模板,利用特异性引物PCYP51G1F:5′- GATACAATGGGGGATGCGGA-3′和PCYP51G1R:5′-ATCACATGTCAGTTGACGAC- 3′进行PCR,获得PpCYP51G1的全长编码序列。
1.2.2 PpCYP51G1氨基酸序列特征分析和二级结构预测 在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi网站利用Blast工具进行序列相似性分析;利用DNAMAN软件预测其编码蛋白并进行蛋白序列比对、系统进化树构建;利用GOR软件(http://.cn/qkpdf/nykx/nykx201310/nykx20131001.pdf" style="color:red" target="_blank">原版全文
CYP51G1R2:5′-GAGCTCGCTGCAAAGCAAAACCCCGA-3′ (划线处为Sac Ⅰ 酶切位点)
pCAMBIA-1301载体(GenBank登陆号为AF234297.1)中带有双CaMV 35S启动子、潮霉素磷酸转移酶基因(hpt Ⅱ)及CaMV 3′UTR区的片段命名为Ⅲ片段(即pCAMBIA-1301载体上8 720~10 795 bp之间的片段),片段大小为2 076 bp,扩增引物如下:
hpt-F:5′-AGCTTGCCAACATGGTGGAGCAC-3′
hpt-R:5′-AATTCGGGGGATCTGGATTTTAGTAC-3′
分别将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ片段克隆到pGEM-T easy 载体上,转化大肠杆菌感受态细胞,经测序鉴定后,提取质粒。首先用Spe Ⅰ和Sac Ⅰ分别双酶切连有Ⅱ和Ⅲ片段的质粒(Ⅲ片段两端的酶切位点为pGEM-T easy 载体自带酶切位点),回收Ⅱ片段和连有Ⅲ片段的线性化质粒,将二者连接后转化大肠杆菌感受态细胞,挑取阳性克隆,经测序鉴定后提取质粒。再用Aat Ⅱ和EcoR Ⅰ双酶切质粒(pGEM-T easy 载体自带酶切位点),同时用Aat Ⅱ和EcoRⅠ双酶切连有Ⅰ片段的质粒,将回收的Ⅰ片段与同时连有Ⅱ和Ⅲ片段的线性化质粒连接,转化大肠杆菌感受态细胞,挑取阳性克隆进行PCR、酶切及测序鉴定,鉴定正确的即为我们需要的PpCYP51G1功能缺失载体。
以该载体为模板,以CYP51G1F1和CYP51G1R2为引物进行PCR扩增,回收目的片段,用PEG介导的原生质体转化方法转化小立碗藓原生质体。小立碗藓原生质体的制备、PEG介导的原生质体转化、再生和转基因植株的筛选参考王凤德等[14]的方法。
取选择性培养基上生长的抗性植株及野生型植株,分别提取其DNA,以抗性植株DNA、野生型植株DNA以及构建的质粒载体为模板,用引物hpt-F和hpt-R进行PCR扩增,鉴定阳性植株。
1.2.4 PpCYP51G1-GFP融合蛋白载体的构建、转化及亚细胞定位 设计带有BamH Ⅰ酶切位点的引物扩增PpCYP51G1基因,所用引物为:CYP51G1-F:5′-GTGGATCCGATACAATGGGGGATGCGGA-3′和CYP51G1-R:5′-GTGGATCCATCACATGTCAGTTGACGAC-3′(划线处为BamH Ⅰ酶切位点),将扩增得到的目的片段通过BamH Ⅰ酶切位点连接到PJIT163质粒载体上,转化大肠杆菌感受态细胞,挑取阳性克隆,进行酶切及测序鉴定,插入方向正确的质粒用PEG介导的转化方法转化小立碗藓原生质体[14]。
将转化后的原生质体25℃黑暗过夜培养,荧光显微镜下观察GFP荧光的分布。
2 结果与分析
2.1 PpCYP51G1基因的克隆
以小立碗藓反转录产物为模板,利用特异性引物PCYP51G1F和PCYP51G1R进行PCR扩增,得到一条约为1.5 kb 的带(图1)。测序结果显示,该基因的编码区长1 509 bp,预测编码488个氨基酸(图2);序列比对发现,其氨基酸序列与拟南芥CYP51G1基因AtCYP51G1(GenBank登录号为NM_101040)的编码蛋白序列的一致性为65%,命名为PpCYP51G1。Blast 检索发现基因组测序已经完成的细菌、真菌和动物中都有PpCYP51G1基因的同源基因。
2.2 PpCYP51G1氨基酸序列特征分析和二级结构预测
2.2.1 PpCYP51G1氨基酸序列同源性分析 对小立碗藓、拟南芥、水稻、衣藻、酵母CYP51G1基因编码的氨基酸序列进行比对(图3)并构建系统进化树(图4),结果表明,PpCYP51G1与拟南芥、水稻、衣藻、酵母CYP51G1的氨基酸序列一致性分别为65%、64%、50%、28%。
2.2.2 PpCYP51G1二级结构预测 利用GOR软件(http://.cn/qkpdf/nykx/nykx201310/nykx20131001-1.pdf" style="color:red" target="_blank">原版全文
3 讨论
本试验从小立碗藓中克隆了CYP51基因PpCYP51G1的全长cDNA编码序列,并对其氨基酸序列进行了分析,结果表明,CYP51G1在植物中具有较高的保守性,PpCYP51G1与拟南芥、水稻、衣藻、酵母CYP51G1的氨基酸序列一致性分别为65%、64%、50%、28%,与细胞色素P450家族其它成员的研究结果类似[14],因此,研究小立碗藓细胞色素P450家族基因的功能对于揭示它们在其它植物中的功能具有借鉴意义。
PpCYP51G1跨膜区的预测结果表明,其N 端存在一个跨膜结构域,而GenBank中对小立碗藓CYP51G1基因(GenBank登录号为XM_001769361)的预测结果则显示其编码蛋白N端无跨膜区,原因是GenBank中预测的氨基酸序列不包括本试验得到的PpCYP51G1蛋白N端的前22个氨基酸(MGDAEMQGAPVGESAVFDRSKV),而这段序列刚好是预测的N端跨膜区。我们认为PpCYP51G1的全长序列应该包括这个跨膜区,GenBank中小立碗藓EST数据库中的数据也证明这段序列是确实存在的。
此外,我们构建了PpCYP51G1基因的功能缺失载体及GFP融合蛋白载体,获得了PpCYP51G1的功能缺失转化体,并对该基因进行了亚细胞定位,为进一步研究其功能奠定了基础。
参 考 文 献:
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