单位文秘网 2021-08-09 08:12:22 点击: 次
摘要:采用PCR扩增酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Ⅲ号染色体ARS304序列(S1)及以ARS304为核心上下游延伸1 kb的侧翼序列(S2),并将目的片段分别构建到酵母整合载体pRS405中,获得重组质粒pRS1和pRS2。质粒电转化试验发现重组质粒pRS2的转化率大于pRS1,说明ARS304侧翼序列能显著提高ARS304在酿酒酵母中自主复制的能力。
关键词:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae);自主复制序列(ARS);重组质粒;复制起始活性
中图分类号:Q785 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2012)21-4891-03
Construction and Identification of Recombinant Plasmids of Saccharomyces cerevisiae ARS304 and Its Flank Sequence
LI Jun,WANG Xin,ZHANG Qi-sheng,CAI Lu
(Institute of Bioengineering and Technology,Inner Monglia University of Science and Technology, Baotou 014010, Inner Monglia,China)
Abstract: ARS304 gene(S1) and its flank sequence(S2) of Saccharomyces cerevisiae were cloned by PCR, and then connected into the shuttle vector pRS405. Recombinant plasmids pRS1 and pRS2 were successfully constructed and used for electroporation of S. cerevisiae. Results showed that the electricity transformation rate of pRS2 was higher than that of pRS1, indicating that flank sequence could improve the autonomously replicating activity of ARS304 in S. cerevisiae.
Key words: Saccharomyces cerevisiae; autonomously replicating sequence(ARS); recombinant plasmids; replication origins activity
复制起始的调控涉及细胞周期的调控、基因扩增、肿瘤发生等重大生物学问题,是真核生物基因表达调控的重要内容。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中复制起始依赖的顺式作用元件被称为自主复制序列(Autonomously replicating sequence, ARS),典型的ARS有一段11 bp富含A/T的保守序列[5’-(A/T)TTTA(T/C)(A/G)TTT(A/T)-3’],称为ACS(ARS consensus sequence),这些位点发生突变时会导致ARS失去活性,进而影响到复制起始的功能。在酿酒酵母Ⅲ号染色体上已发现有19个ARS元件,但却存在超过3 800个与ACS相似的序列,并且其中60%的序列能与ACS的8~10个位点匹配[1],说明自主复制并不单纯受ACS元件数目、方向以及解旋基序数目所控制,其活性可能还与其他因素有关,诸如ARS侧翼序列特征、核小体定位、染色质修饰等[2]。对酵母的ARS进行研究,了解酵母染色体复制起始机制,有利于进一步在表观遗传学水平上探究真核生物复制机理。本实验构建并鉴定酿酒酵母ARS304及其侧翼序列重组质粒,以期为以酵母为模式生物研究真核基因复制机制提供参考。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 Esherichia coli DH5α为内蒙古科技大学基因工程实验室保藏。酿酒酵母YPH499(MATa ura3-52 lys2-801amber ade2-101ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1)、穿梭质粒pRS405由美国新泽西州医学院微生物学与分子遗传学部Carol S. Newlon教授提供。
1.1.2 酶与试剂 DNA Marker、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、PCR产物纯化试剂盒购自TaKaRa公司,Agarose购自Invitrogen公司。PCR引物合成及DNA测序工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
1.1.3 培养基和培养条件 大肠杆菌的培养使用LB培养基(胰蛋白胨10 g/L+NaCl 10 g/L+酵母浸提物5 g/L,固体培养基添加15 g/L琼脂),培养条件为37 ℃振荡培养24 h;酵母YPH499的培养使用YPD培养基(胰蛋白胨 20 g/L+酵母浸提物10 g/L,高压灭菌20 min后加入100 mL灭菌的20 g/L葡萄糖溶液,固体培养基添加15 g/L琼脂),培养条件为28 ℃暗培养18 h。
1.2 方法
1.2.1 珠磨法提取酿酒酵母基因组DNA 收集培养16~18 h的酵母YPH499菌液,用TE洗涤2次后溶于200 μL TE;加入50 mg玻璃珠(直径0.3~0.5 mm)和100 μL苯酚—氯仿(体积比25∶24,下同),涡漩振荡2~3 min,12 000 r/min离心2 min;取上清,加入等体积苯酚—氯仿,振荡混匀后12 000 r/min离心5 min;取上清,加入0.5 μL Rnase A,37 ℃温浴30 min;加入2倍体积的无水乙醇,-20 ℃静置30 min;10 000 r/min离心5 min,沉淀物用70%(体积分数,下同)的乙醇洗2次,自然干燥后溶于20 μL TE,采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA[3]。
1.2.2 ARS304及侧翼序列片段PCR扩增及纯化 根据Saccharomyces Genome Database中酿酒酵母Ⅲ号染色体上的ARS304序列设计两对引物分别扩增酿酒酵母ARS304(S1)及以ARS304为核心上下游延伸1 kb的序列(S2)。引物序列分别为PF1:
5′-CGGGATCCCGGAAGTGCAGAACAAAGAGG-3′
(BamHⅠ),PR1:5′-CGCGAGCTCGGCAGGAGCAG
CACACAGATC-3′(SacⅠ);PF2:5′-CGGGATCCCGC
TAGTGCTTAAGTTCTGTTG-3′(BamHⅠ),PR2:
5′-CGCGAGCTCGGCAGTCTTTAAACGCGCCTT-3′
(SacⅠ)。
以酿酒酵母YPH499基因组为模板,利用上述引物扩增酿酒酵母ARS304及侧翼序列。扩增体系为50 μL:ddH2O 37 μL、10×Buffer(Mg2+) 5 μL、dNTPs 4 μL、PF (10 μmol/L) 0.5 μL、PR(10 μmol/L) 0.5 μL、Taq DNA聚合酶1 μL、DNA模板2 μL。扩增程序为95 ℃ 4.0 min;95 ℃ 30 s,51 ℃ 35 s(S2:48 ℃ 45 s),72 ℃ 1 min; 72 ℃ 10 min,30个循环。0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,并采用纯化试剂盒进行回收纯化。
1.2.3 重组质粒pRS1、pRS2的构建 对纯化后的PCR产物和酵母穿梭载体pRS405进行BamHⅠ/SacⅠ双酶切;连接pRS405酶切大片段和S1(S2)双酶切产物;连接产物转化大肠杆菌DH5α;提取质粒,对其分别进行PstⅠ/SacⅠ和SacⅠ/Hind Ⅲ双酶切验证,验证正确的重组质粒命名为pRS1及pRS2。
1.2.4 酵母电转化 具体方法参考文献[4],转化效率=产生的转化子数/质粒DNA质量。
2 结果与分析
2.1 酿酒酵母基因组DNA的提取结果
酿酒酵母细胞壁厚约25 nm,以葡聚糖为主,有一定韧性。因此提取酵母基因组DNA的关键在于选择一种合适的方法破壁,使菌体内的核酸释放出来。目前报道的酵母基因组DNA的提取方法主要有碱裂解法、液氮研磨法、超声波法、复合酶法、珠磨法等。本实验采用珠磨法提取酵母基因组,琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1,可以看出,提取的酵母基因组DNA条带清晰明亮,没有拖带。珠磨法价格便宜,操作简单,提取的酿酒酵母基因组满足后续扩增目的片段的需要。
2.2 S1、S2序列的PCR扩增
以酿酒酵母YPH499基因组为模板扩增ARS304(S1,486 bp)和以ARS304为核心上下游延伸1 kb的侧翼序列(S2,2 358 bp),采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,结果见图2、图3。从图中可以看出,目的片段条带单一清晰、大小与预期相符。
2.3 重组质粒pRS1及pRS2克隆的鉴定
将PCR扩增产物S1及S2经BamHⅠ/SacⅠ双酶切后分别连接到穿梭载体pRS405上,连接产物转化大肠杆菌DH5α,随机挑取转化子,提取质粒后分别用Pst Ⅰ/Sac Ⅰ和Sac Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切检测(图4、图5)。结果显示,重组质粒pRS1经过Pst Ⅰ/Sac Ⅰ双酶切后出现大小两条带,短片段的大小约为550 bp;重组质粒pRS2经过Sac Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切后出现两条带,大小约为5 500 bp和2 400 bp,均与预期相符。
2.4 重组质粒pRS1及pRS2功能鉴定
酵母转化效率是鉴定自主复制活性强弱的直接指标。本实验以整合型质粒pRS405为阳性对照,将构建的重组质粒pRS1及pRS2电转化酿酒酵母YPH499,在SD平板上筛选Leu+的转化子,根据酵母转化效率判断3种质粒的自主复制活性,结果见图6。图6显示整合型质粒pRS405由于其复制依赖于整合到酵母的染色体上,转化率低(6转化子/μg DNA),而同等条件下在pRS405多克隆位点插入ARS304,整合型质粒转变成复制型质粒pRS1,转化率是原来的8.8倍(53转化子/μg DNA);重组质粒pRS2由于包含以ARS304为核心上下游延伸1 kb的侧翼序列,转化率有了显著提高(324转化子/μg DNA),说明ARS304侧翼序列能显著提高ARS304的自主复制活性。
3 小结与讨论
在真核细胞中,DNA复制是在特定复制起始点上开始的。酵母中潜在的起始点比在每个细胞周期中实际使用的起始点要多。虽然在酵母中大多数ARS都被复制起始识别复合体(Origin recognition complex,ORC)结合[5],但其中有些位点的使用频率比其他位点的更高,且有一些潜在的起始点在正常生长条件下从不使用。但是当克隆到质粒上时,这些序列也能作为有效的起始点行使功能[6]。因此,在酵母细胞核中染色体的环境能决定哪些潜在的位点被用作起始点以及使用的频率。如酵母Ⅲ号染色体上有19个ARS,但由于侧翼序列的影响,并不是所有的都具有复制起始活性或活性较低[7]。Srienc等[8]研究发现敲除Ⅲ号染色体上其他高活性ARS时,ARS304的复制起始活性会大大增强。Eaton等[2]利用高通量的序列分析测定了酵母体内ARS两侧的核小体定位图谱,发现酵母复制起始位点ARS两侧的核小体分布具有一定的规律,且ORC的结合也需要ARS两侧精确的核小体定位。
本研究成功构建了酵母Ⅲ号染色体HML区外第一个活性较低的ARS304及以ARS304为核心上下游延伸1 kb的侧翼序列的重组质粒pRS1和pRS2。质粒电转化试验发现ARS304侧翼序列能显著提高ARS304的复制活性。后续研究将在pRS1、pRS2重组质粒上组装核小体,研究核小体的分布及定位对复制起始活性的影响。
参考文献:
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[3] 赵宏宇,李 珺,蔡 禄,等.4种酵母基因组提取方法的比较[J]. 食品科学,2011,32(9):170-173.
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[8] SRIENC F, BAILEY J E, CAMPBELL J L. Effect of ARS1 mutations on chromosome stability in Saccharomyces cerevisiae[J]. Molecular and Cellular Biology,1985,5(7):1676-1684.
收稿日期:2011-12-16
基金项目:国家自然科学基金(61072129);内蒙古科技大学创新基金(2011NCL005)
作者简介:李 珺(1979-),女,宁夏石嘴山人,讲师,硕士,主要从事表观遗传学研究,(电话)15847087336(电子信箱)star1979@126.com;
通讯作者,蔡 禄,男,教授,博士生导师,主要从事生物信息学与分子生物学研究工作。
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