单位文秘网 2021-07-08 08:24:22 点击: 次
【摘要】目的检测DC细胞上是否有酸敏感离子通道(ASICs)基因表达,为之后DC细胞与ASICs关系及酸性微环境影响DC细胞功能的分子路径等研究奠定基础。方法提取DC2.4细胞的总RNA并逆转录为cDNA,以小鼠海马组织作为阳性对照,GAPDH作为内参,用针对ASIC1保守序列的引物(含限制性内切酶的酶切位点)进行PCR检测,选取ASIC1相应条带,用DpnⅠ酶切,连接到T19载体上,转染至DH5ɑ细菌中,在含有氨苄青霉素的培养基中扩增,小量提取单克隆菌群的质粒,再次用DpnⅠ酶切,将酶切产物与DC2.4细胞的PCR产物分别电泳,选择有与DC2.4细胞相同条带的菌群进行测序,并利用BLAST对测序结果与NCBI中搜索的ASIC序列进行比对。结果RT-PCR检测发现DC2.4存在与ASIC1对应mRNA相同长度的条带;测序结果证实其为ASIC1对应的mRNA序列。结论DC2.4细胞上有ASIC1对应mRNA的表达,ASIC1可能在酸性微环境影响DC细胞功能的途径中发挥作用。
【关键词】树突状细胞;酸敏感离子通道;酸性微环境
Expression of acid-sensing ion channels gene on dendritic cells YANG Qin,YAN Xiao,TAN Zheng.Tongji Medical College of Huazhong University of Science & Technology,Wuhan 430000,China
【Abstract】ObjectiveTo detect whether the ASIC genes express on the DC cells, to lay the foundation for the study such as the relationship between DC cells and ASICs,the molecular pathways of the acidic microenvironment affecting DC cells function.MethodsExtracting the reverse transcript the total RNA of DC2.4 cells to cDNA.PCR and electrophoresis using primers of the Conservative ASIC1 sequence,while mouse hippocampus as a positive control,GAPDH as a reference.Selecting the corresponding strip of ASIC1.Cuting the PCR product via Dpn Ⅰ Enzyme,connect them to the T19 vector,and transfect to DH5α bacteria,which is trained in the medium containing ampicillin.Then extracted a little of plasmid from a monoclonal flora, cut with Dpn Ⅰ Enzyme again,and Electrophoresis.Selecting the flora with the same bands with the ones of DC2.4 cells,sequencing and comparing with the sequencing result from NCBI via BLAST.ResultsRT-PCR of DC2.4 cell detected a band of similar length with the corresponding mRNA of ASIC1;And it was confirmed by the results of sequencing. ConclusionThere is the corresponding mRNA of ASIC1 expression on DC2.4 cells.It is probable that ASIC1 produce a marked effect in the pathway which the acidic micro-environment affects DC cells.
【Key words】Dendritic cells (DC);Acid-sensing ion channels (ASICs);Acidic micro-environment
树突状细胞(Dendritic cell,DC)因其形态具有树突样或伪足样突起而命名,是目前所知的机体免疫系统中功能最强的一种专职的抗原呈递细胞(APC)[1],能有效激活初始型T细胞,在免疫应答的启动、调控上起着关键的作用。体内大部分DC处于非成熟状态,DC细胞摄取、处理及呈递抗原,发挥其功能的过程也就是它分化、迁移、成熟的过程[2],多种不同的刺激可激发DC细胞从不成熟的抗原捕获细胞到成熟的抗原呈递细胞的转化,也就间接地影响到免疫应答的启动。
研究表明,酸性微环境(pH值6.5)能显著刺激DC细胞摄取FITC-OVA、FITC-dextran和HRP,而在pH值7.3的环境中,要使DC细胞达到与在pH值6.5环境中同样的胞饮作用,细胞外抗原浓度须达到后者10倍以上的浓度。此外,酸性环境还能上调CD11c、MHCⅡ分子、CD40、CD86的表达和DC细胞呈递抗原的能力[3,4]。
酸敏感离子通道(ASICs)是一类可以直接被组织酸化(即质子,H+)激活的离子通道,有4种亚型,广泛分布于全身各组织,参与从学习记忆到细胞损伤等多种生理和病理过程[5]。现已发现,ASICs在缺血缺氧性损伤和炎症等与酸中毒相关的多种病理生理过程中发挥着重要的作用[6]。由此推测,酸性微环境可通过ASICs促进DC细胞的成熟和功能的发挥,从而影响机体的免疫应答。
然而,目前还未发现有DC细胞与ASICs相关的研究,本实验旨在检测DC细胞上是否有ASICs基因表达,以期为DC细胞与ASICs之间的关系及酸性微环境影响DC细胞功能的分子路径等研究奠定基础。
1材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1细菌菌株、细胞系DC2.4细胞系、DH5α细菌和T19载体为本实验室保存。
1.1.2引物引物由本实验室用Primer 5.0和Oligo软件设计,上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.1.3试剂Trizol试剂购自北京华舜;PCR Taq、dNTP Mixture、10×PCR Buffe、T4DNA连接酶、Dpn Ⅰ限制性内切酶购自Takara公司;DL2000 marker购自上海博道;DMSO、DEPC购自Amresco公司;逆转录试剂盒购自Fermentas公司;1640培养基购自Gibco2BRL公司;胎牛血清(FBS) 购自HyClone公司;微量质粒提取试剂盒购自U2gene公司;其他试剂为国产分析纯。
1.1.4仪器Eppendorf Mastercycler Personal聚合酶链式反应仪;HITACHI U-2000型可见光-紫外分光光度仪;北京六一仪器厂DYY-5型稳压稳流电泳仪;Heraeus Multifuge 3S-R型超速低温离心机;Hera cell 100二氧化碳培养箱;上海培清科技有限公司IS-300凝胶成像仪。
1.1.5DNA测序由上海生工生物工程技术服务有限公司操作。
1.2方法
1.2.1DC2.4细胞的培养复苏冻存的DC2.4细胞系,用自配含10%FCS、10%的胎牛血清的1640培养基培养,细胞计数估算每一瓶内细胞数量在(5~7)×106。于第1、3、5、7天换液,第8天收获细胞。细胞观察:细胞大部分为不规则形状,长有突起,细胞间相互接触,甚至通过突起发生远距联系。长有突起是成熟DC细胞的形态学标志,说明将要检测的细胞已有足量成熟DC细胞。
1.2.2总RNA抽提急性分离小鼠海马作为阳性对照,用TRIZOL试剂分别提取出所培养的DC2.4细胞和小鼠海马的总RNA,RNA浓度稀释倍数为10倍,测定结果如表1所示。立即使用Pure Extreme试剂盒逆转录为总cDNA,其反应体系中总RNA均加入3 μl。
表1RNA浓度测定结果
OD260/OD280RNA浓度(μg/ml)
DC2.41.8941.7
小鼠海马组织1.8666.7
1.2.3PCR及电泳将逆转录所得的DC2.4细胞和海马的cDNA分别用ASIC引物进行PCR和电泳。ASIC引物为自行设计,引物及引物之间共140 bp,为人和鼠科、ASIC不同亚型保守序列的一部分。上下游引物均含有Dpn Ⅰ酶切位点,上游引物为TTG、CTG、TCA、CTT、GCC、AGT、TGT,下游引物为AAT、GCT、TTC、TGC、TCC、CAG、TTC。反应体系为:2×buffer 10 μl,cDNA 3 μl,引物(GAPDH) 1 μl,引物(ASICI 2 μl,Taq 酶 1 μl,Dd H2O、3 μl,其中GAPDH为内参。反应条件: 94 ℃、4 min, 98 ℃、30 s, 52 ℃、30 s,72 ℃、30 s,70 ℃、10 min,40个循环。电泳使用的是2%琼脂糖凝胶,配方为:0.5×TBE、50 ml,琼脂糖1.0 g,Goldview 2.6 μl,电泳电压为80 V。电泳有三种样品,分别为marker、海马、DC2.4细胞。其中marker条带由小到大依次为:100、250、500、750、1000、2000 bp。
1.2.4测序(1)PCR扩增产物切胶回收:PCR产物全部用2%琼脂糖凝胶电泳回收,在紫外灯下用刀片切下含目的基因的胶块,按OMEGA凝胶回收试剂盒说明书进行操作。(2)构建质粒:将回收的PCR 产物及载体质粒进行Dpn Ⅰ酶切反应1 h,产物使用T4DNA连接酶16 ℃过夜连接。(3)转化细菌并扩增:将构建的质粒转化氯化钙制备的新鲜单克隆DH5α感受态菌并接种到含有氨苄青霉素的Luria Bertani(LB)琼脂培养板,37 ℃ CO2孵箱倒置培养12 h。(4)选择菌落:挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的LB 培养基中,37 ℃振摇过夜。小量提取质粒,再次用Dpn Ⅰ酶切,将酶切结果与DC2.4细胞的PCR产物分别电泳,选择有与DC2.4细胞相同条带的菌群送公司测序。(5)利用BLAST对测序结果与NCBI中搜索的ASIC序列进行比对。
2结果
2.1PCR及电泳结果,见图1。图1从左到右依次为marker、海马、DC2.4。marker条带由小到大依次为:100、250、500、750、1000、2000 bp。图中海马与DC2.4得到的结果相同,两条带均在100 bp与250 bp之间,其中第一条带略靠近100 bp的条带,第二条几乎与250bp的条带平齐,这与原设计的ASIC引物之间片段(140 bp)和内参GAPDH(234 bp)相符,可初步断定第一条条带是我们要检验的ASIC片段,即说明DC2.4细胞上有表达ASIC1的mRNA。
2.2测序结果利用BLAST将测序结果(图2)与NCBI中搜索的ASIC序列进行比对,测出的序列的确为原设计的ASIC引物间序列(图3)。由此可以肯定DC2.4细胞系有表达ASIC蛋白相关的mRNA,从而可推断ASIC1可能介导某些分子路径,在DC细胞系的细胞分裂、生长、分化、迁移、成熟过程中发挥作用。
3讨论
基因通过转录为RNA才能表达为蛋白质,以上实验通过提取细胞总RNA、逆转录为总cDNA后检测出有ASIC1基因片段,说明DC2.4细胞系中有ASIC1相应的RNA,即有ASIC1膜蛋白的表达。
酸性外环境能够被DC2.4细胞系细胞感知,并加速其成熟过程、功能的行使。而ASICs即一类可以直接被组织酸化(即质子,H+)激活的离子通道,以上实验验证了DC细胞系上的确存在ASIC1的相关mRNA。结构决定功能,DC细胞上表达了ASIC蛋白,则必然有ASIC相关的作用路径,并因此参与DC细胞的生物学过程。
应当注意的是,酸碱度是决定细胞生存的基本环境因素之一,因此细胞外酸环境对DC细胞成熟与功能的促进可能不限于ASIC所介导的分子路径,也有可能是通过改变细胞生存必须或功能相关的酶及其他分子特性而提高细胞活性,或作用于其他质子可作用的未知的离子通道和其他可能的方式而发挥其影响。
下一步的研究即ASIC1在DC细胞中相关的具体分子通路,对DC成熟过程的哪些步骤发生影响。以上实验是利用细胞系细胞在体外进行的,与体内真实情况有所差别,而且DC细胞有多种亚型,不同亚型膜分子表达、作用方式和功能存在差异[7],因此首先要确定非细胞系DC细胞和DC细胞的多种亚型是否也表达ASIC1;研究观察不同时期处于不同成熟状态下的DC细胞上ASIC1表达的程度与其变化;影响其表达的因素和其作用的下游路径;ASIC1阻断剂对DC细胞及其作用的T细胞的影响;在真实生理环境,即动物体内ASIC1阻断对免疫应答的改变。
树突状细胞是免疫应答的启动、调控的关键,在移植排斥、抗肿瘤、抗病毒感染和自身免疫疾病中发挥着重要作用[8,9],其成熟状态决定免疫应答的结局。它在不同的环境、不同的成熟状态下,可能产生相反的作用,比如是启动强烈的免疫反应还是诱导免疫耐受[10]。由于其重要的功能和特殊的生物学特性,DC逐渐成为免疫学研究领域的热点之一,在其基础研究及临床上,正逐渐走向深入,并且已经取得了有价值的初步成果,如DC抗肿瘤疫苗等[11~13],以DC为基础的免疫治疗将成为广泛临床治疗领域中十分重要的一种方法,可能使生物治疗真正成为继手术、化疗、放疗之后的又一治疗的有效武器。而ASICs对DC成熟过程与功能行使的调节机制的深入了解,也为临床许多疾病,尤其是酸性微环境和酸中毒相关的炎性病症的以DC细胞为基础的免疫治疗提供了一个新的靶点与技术策略[14,15]。
参考文献
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【收稿日期】2011-09-19
通讯作者:谭政
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