单位文秘网 2021-07-17 14:02:29 点击: 次
摘要:采用稀释平板法分离马铃薯瓢虫肠道菌,利用刚果红平板法对产纤维素酶菌株进行初筛,选取透明圈较大的菌株进行摇瓶发酵复筛,根据菌株形态、生理生化特征对菌株进行初步鉴定,通过正交法优化产酶条件。结果表明,经初筛和复筛得到1株酶活相对较高的菌株B-12,经初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。1.25%麦芽浸粉为碳源、1.5%KNO3为氮源、0.2%的NaCl、0.1%的CMC-Na、接种量6%、培养时间44 h为B-12产酶的适宜条件。优化后发酵液中的内切葡聚糖酶活(CMCA)为111.710 U/mL,较培养44 h后的酶活提高了8.78%;滤纸酶活(FPA)为35.017 U/mL,提高了387.23%;β-葡萄糖苷酶酶活(BGL)为116.799 U/mL,提高了700.38%。
关键词:马铃薯瓢虫;肠道菌;纤维素酶;优化
中图分类号:Q935文献标识码:A文章编号:0439-8114(2011)05-0915-06
Screening,Identification and Cultural Condition Optimization of Cellulase-producing Strains from the Intestine of Henosepilachna vigintioctomaculata
RUAN Zhou-bo,WANG Yi-li,HE Wei-nan,ZHENG Jiang-yan,ZHANG Xia,CHEN Qiong,
HU Song-ying,ZHANG Ying-lao
(College of Chemistry and Life Sciences, Zhejiang Normal University,Jinhua 321004,Zhejiang,China)
Abstract: The bacteria from the intestine of Henosepilachna vigintioctomaculata were isolated through the pour plate method. They were preliminarily screened using Congo red medium plate method, and then screened according to their cellulase activities by flask shaking fermentation method. The strain was identified based on morphological and physiological characters. In addition, the culture substrates and fermentation conditions were optimized by orthogonal experiment method. A high cellulase-producing strain B-12 was screened from the intestine of H. vigintioctomaculata and it was identified as Bacillus sp.. The best culture conditions were as follows: substrate were 1.25% malt meal, 1.5% KNO3, 0.2% NaCl, and 0.1% CMC-Na, inoculation quantity was 6%, culture time was 44 h. In this condition, the enzyme activity of CMCase, filter paper enzyme (FPA), and β-glucosidase (BGL) were 111.710, 35.017, and 116.799 U/mL respectively, which were 8.78%, 387.23% and 700.38% higher than those of the initial strain respectively.
Key words: Henosepilachna vigintioctomaculata; intestinal bacteria; cellulase; optimization
地球上的生物资源主要来自光合生物,其中90%以上为木质纤维素类物质,它们代表了生态系统中营养金字塔最庞大的基层[1]。天然的木质纤维素材料含有纤维素、半纤维素和木质素等。其中纤维素是地球上最丰富的多糖物质,这类物质是植物细胞壁的主要成分,也是地球上最廉价的可再生资源。另外,人类活动产生的废弃物中也含有大量的纤维素[2]。目前,人们对纤维素的降解和利用主要通过纤维素酶的分解来实现。纤维素酶在再生能源利用方面具有广阔的应用前景,可应用于农业、酿造工业、发酵工业、食品工业以及其他领域[3-9]。因此研究纤维素酶有着十分重要的意义。
昆虫肠道菌是指能定植于昆虫肠道的微生物,包括土著的昆虫肠道菌和能定植于昆虫肠道环境的微生物[10]。研究表明一些昆虫肠道菌能帮助昆虫消化食物[10]。对喜食含纤维素食物的昆虫,我们推测其消化纤维素可能与其肠道菌分泌纤维素酶有关。马铃薯瓢虫主要为害茄科植物,喜食茄科植物叶片,它消化叶片中的纤维素可能与其肠道菌有关。本试验从马铃薯瓢虫肠道中分离筛选产纤维素酶菌株并对其产酶条件进行优化,旨在为发现新的纤维素酶高产菌株奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株采自浙江省金华市婺城区高村附近马铃薯田地的马铃薯瓢虫肠道中的菌株。
1.1.2培养基①菌种保藏培养基:牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏0.30%,蛋白胨1.00%,NaCl 0.50%,琼脂1.50%~2.00%,pH值7.4~7.6)。②初筛培养基:米糠2.00%,NaCl 0.10%,K2HPO4 0.50%,MgSO4·7H2O 0.02%,(NH4)2SO4 0.06%,琼脂1.50%~2.00%,pH值7.0~7.2。③刚果红纤维素鉴定培养基:羧甲基纤维素钠(CMC-Na)0.30%,NaCl 0.50%,牛肉浸膏0.15%,蛋白胨 0.50%,琼脂 1.50%~2.00%,pH值7.0~7.2。④种子培养液:酵母膏 1.00%,蛋白胨 1.00%,NaCl 0.50%,CMC-Na 0.50%,pH值7.0~7.2。⑤液体产酶发酵培养液:配方同种子培养液。⑥鉴定用培养基:糖发酵试验培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水解培养基、Simons氏柠檬酸盐培养基、明胶水解试验培养基等。
1.1.3主要试剂葡萄糖、pH值4.6的醋酸缓冲液、DNS、2% CMC-Na底物溶液、0.05%水杨苷的醋酸缓冲液、蛋白胨、牛肉膏等。
1.1.4主要仪器立式电热压力蒸汽灭菌锅,上海中安医疗器械厂生产;LRH-250生化培养箱,上海一恒科技有限公司生产;D-78532台式冷冻离心机,德国Hettich公司生产;UV-7504紫外可见分光光度计,上海欣茂仪器有限公司生产;SW-CJ-1B型单人单面净化工作台,苏州净化设备有限公司生产;电子天平,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司生产;HH-4数显恒温水浴锅,山东鄞城科源仪器设备厂生产;远红外快速恒温干燥箱,上海跃进医疗器械厂生产。
1.2方法
1.2.1纤维素酶产生菌的分离、纯化和初筛马铃薯瓢虫饥饿24 h后,无菌条件下在75%酒精中表面消毒2 min,去离子水漂洗3次,采用稀释平板法分离肠道菌。待菌长出后用无菌牙签挑选单菌落于刚果红纤维素鉴定培养基上影印2~3皿,37℃下培养2~3 d。取其中1皿采用刚果红染色法鉴定其产酶能力[11]。对产生透明圈的菌株进行测量并记录D/d值(D为透明圈直径,d为菌落直径,下同),挑选
D/d值大于1的菌株作为初筛菌种,通过连续划线法,分离纯化。得到的初筛菌株转接到保藏斜面,4℃条件下保藏备用。
1.2.2纤维素酶产生菌的复筛将初筛到的菌株活化后接种于30/250 mL(250 mL三角瓶装30 mL培养液,下同)种子培养基中,37℃、180 r/min摇床培养过夜。以2%接种量转接于30/250 mL产酶培养基中,37℃、180r/min培养2~3 d,10 000 r/min冷冻离心10 min,取上清液测定酶活,筛选产纤维素酶最高的菌株。
1.2.3酶活力测定测定方法参照文献[12-16]修正得到。
1)标准曲线绘制。反应的总体系为3.5 mL,1 mg/mL葡萄糖溶液和去离子水共2 mL,DNS试剂1.5 mL。取10支试管编号分别为1~10。分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL葡萄糖溶液至1~10号试管中;然后分别吸取2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 mL去离子水至相应的1~10号试管中。向1~10号试管中分别加入1.5 mL DNS试剂。将上述试管一同沸水浴5 min,冷却后稀释至10 mL,在540 nm下用分光光度计测吸光值,绘制葡萄糖标准曲线。
2)内切葡聚糖酶活力(CMCase activity,CMCA)测定。取4支干净试管,编号(分别为1~4)后加入1.5 mL底物溶液,并向1号试管中加入1.5 mL DNS溶液以钝化其中的纤维素酶,作为空白对照,比色调零。4支试管置于50℃水浴中预热5 min,再加入0.5 mL酶液(液体发酵液的离心上清液),50℃水浴30 min后立即向2、3、4号试管加入1.5 mL DNS溶液以终止酶反应。充分摇匀后沸水浴5 min,取出冷却后,加入去离子水定容至10 mL,充分混匀。以1号试管为空白对照,540 nm测吸光值,2、3、4号3支试管数值取平均值。
3)滤纸酶活力(FPA)测定。方法同上,将底物溶液换成1 mL缓冲液和50 mg滤纸,加入的酶液量为1 mL,反应时间为1 h。
4)β-葡萄糖苷酶活力(BGL)的测定。方法同上,将底物溶液换成1.5 mL含0.05%水杨苷的醋酸缓冲液,反应时间为1 h。
5)酶活定义。在上述条件下,1 mL粗酶液所产生的1 μg葡萄糖定义为一个酶活力单位(U)。以上的测定中均已扣除了粗酶液中所含有的还原糖量。
1.2.4产纤维素酶菌株的鉴定①菌株的形态特征:菌株平板培养2~3 d,观察菌落形态特征,菌体形态经染色(革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色等)后,于显微镜的100倍油镜下观察并照像。②菌株的生理生化特性:生理生化试验包括糖发酵试验、V. P试验、甲基红试验、吲哚试验、柠檬酸盐利用试验、淀粉水解试验、明胶水解试验等。
1.2.5产酶条件的优化对复筛得到的菌株进行产酶条件的优化试验。
1)摇瓶生长曲线的测定。在基础培养基的基础上,对复筛得到的菌株测定其在摇瓶培养中的生长曲线和产酶曲线,考察菌体生长状况与菌株产酶能力在时间上的相关性。
2)接种量的确定。将培养12 h的种子液分别以1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%的接种量转接入30/250 mL产酶培养基中,置于37℃,180 r/min摇床培养,测定酶活,考察不同接种量对菌株产酶的影响。
3)培养基成分的优化。①碳源种类对菌株产酶的影响:分别以1%的CMC-Na、葡萄糖、蔗糖、乳糖、酵母膏、牛肉膏、酵母粉、麦芽浸粉、秸秆汁、米糠作为碳源,摇瓶培养后测定酶活,考察碳源种类对菌株产酶的影响。②氮源种类对菌株产酶的影响:分别以1%的(NH4)2SO4、NH4NO3、KNO3、蛋白胨、尿素、酵母膏、酪蛋白胨作为氮源,以1%葡萄糖作为碳源,摇瓶培养后测定酶活,考察氮源种类对菌株产酶的影响。③NaCl浓度水平对菌株产酶的影响:在原始液体产酶培养基的基础上分别加入0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%的NaCl,摇瓶培养后测定酶活,考察NaCl浓度水平对菌株产酶的影响。④底物(CMC-Na)浓度水平对菌株产酶的影响:在原始液体产酶培养基的基础上分别加入0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%的CMC-Na,摇瓶培养后测定酶活,考察底物浓度水平对菌株产酶的影响。⑤根据上述试验得到的最适培养基组成,选取L9(34)型正交表设计正交试验,试验因素和水平见表1,以上清液酶活大小为指标,选择最优培养基组成。
2结果与分析
2.1纤维素酶产生菌的初筛
采用刚果红染色法从瓢虫肠道中分离纯化得到16株透明圈较大的细菌,细菌编号及其D/d值分别为:B-1,6.167;B-35,5.667;B-11,5.000;B-19,4.750;B-9,4.000;B-26,3.750;B-37,3.000;B-27,1.833;B-53,3.000;B-47,2.714;B-36,2.667;B-42,2.571;B-32,2.500;B-46,2.429;B-12,2.083;B-10,1.420。
2.2纤维素酶产生菌的复筛
对初筛得到的16株菌株进行摇瓶复筛,以CMCA为指标,筛选出B-12、B-10、B-53、B-11等4株产纤维素酶活力较高的菌株,CMCA(3次测定的平均值)分别为76.85、68.85、53.94、71.27 U/mL。菌株B-12的CMCA最高,该菌株用以后续的试验。
2.3DNS法葡萄糖标准曲线
葡萄糖标准曲线如图1所示,得到方程y=0.916 9x-0.110 4,r2=0.991 4。
2.4菌株B-12的初步鉴定
2.4.1形态特征菌株B-12在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上菌落较大、圆形、边缘整齐、不透明、乳白色、微隆起、湿润、生长较快。显微镜观察细胞呈杆状,两头稍平;周生鞭毛,革兰氏染色呈阳性;芽孢椭圆形或柱状,中生或偏端生,芽孢囊不膨大。
2.4.2生理生化特征V.P反应为阴性,吲哚反应、甲基红反应为阳性。该菌株可利用葡萄糖产酸,能水解淀粉,分解明胶,不能利用柠檬酸盐。结合形态特征和生理生化特征,参考《伯杰细菌鉴定手册》第八版,将菌株B-12鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。
2.5产酶条件的优化
2.5.1摇瓶生长曲线的确定在原始培养基基础上从发酵开始至72 h,连续取样,在600 nm下测定生物量,离心后取上清液测定酶活,得到与时间相关的该菌株的生长曲线以及产酶曲线(图2、图3)。由图2、图3可知,在3 h左右菌株进入对数生长期,16 h左右菌株生长开始进入稳定期,44 h以后开始进入衰亡期。CMCA、FPA、BGL开始时增长较为缓慢,CMCA、BGL在44 h时达到最大值,FPA在47 h时达到最大,综合考虑将最佳培养时间定为44 h。总体趋势表明菌株B-12的产酶能力与菌体生长状况有耦连相关性。在44 h时CMCA为102.694 U/mL,FPA为7.187 U/mL,BGL为14.593 U/mL。
2.5.2不同接种量对菌株酶活力的影响不同接种量对菌株酶活力的影响结果见图4。综合考虑,在接种量为6%时3个酶活指标均较高,CMCA为73.901 U/mL,FPA为8.232 U/mL,BGL为7.140 U/mL。因此最佳接种量选择6%。
2.5.3不同碳源对菌株B-12酶活力的影响碳源对微生物生长代谢的作用主要是提供细胞碳架、细胞生命活动所需的能量以及合成产物的碳架。根据微生物所能产生的酶系不同,不同的微生物可利用的碳源不同。在产酶培养基的基础上改变不同的碳源检测菌株B-12的产酶情况。由图5可知,不同种类的碳源对菌株产纤维素酶影响不同,其中麦芽浸粉作为碳源时3个酶活指标均较高,CMCA为74.592 U/mL,FPA为6.778 U/mL,BGL为7.667 U/mL。因此确定麦芽浸粉作为菌株B-12的产酶培养基的适宜碳源。
2.5.4不同氮源对菌株酶活力的影响氮源是合成菌体蛋白质、核酸及其他含氮化合物的重要组成成分。不同种类的氮源对菌株的产酶影响结果见图6。当KNO3作为氮源时,3个酶活指标均较高,CMCA为230.080 U/mL,FPA为101.636 U/mL,BGL为93.009 U/mL。因此确定该菌株的产酶培养基的适宜氮源为KNO3(图6)。
2.5.5NaCl浓度对菌株酶活力的影响试验设置了0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%等10个NaCl浓度梯度,在不同NaCl浓度下测定纤维素酶的3个酶活指标。由图7可知,当NaCl浓度为0.2%时,CMCA活性最高,为75.137 U/mL,FPA和BGL活性相对较高,分别为5.533 U/mL和7.485 U/mL。因此,NaCl浓度为0.2%时菌株B-12的酶活较大。
2.5.6底物(CMC-Na)含量对菌株酶活力的影响试验测定CMC-Na不同添加量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%)时菌株B-12的产酶水平。由图8可知,当CMC-Na浓度达到0.2%时,CMCA活性最高,为90.043 U/mL,FPA和BGL活性相对较高,分别为7.287 U/mL和7.213 U/mL;表明菌株B-12适宜底物(CMC-Na)浓度为0.2%。
2.5.7最适培养基组成确定选取L9(34)型正交表设计正交试验,以上清液酶活大小为指标,选择最优培养基组成。对正交试验结果进行极差分析(表2)可以发现对于CMCA酶活而言,主要因素的影响顺序为:麦芽浸粉>NaCl>KNO3>CMC-Na,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉、1.0% KNO3、0.1% NaCl、0.2% CMC-Na。对于FPA酶活,主要因素的影响顺序为:CMC-Na>NaCl>KNO3>麦芽浸粉,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉、1.5% KNO3、0.2% NaCl、0.1% CMC-Na。对于BGL酶活,主要因素的影响顺序为:KNO3>CMC-Na>麦芽浸粉>NaCl,最佳组合为:1.25%麦芽浸粉、1.5% KNO3、0.2% NaCl、0.1% CMC-Na。综合考虑,最终确定最佳培养基配方为:1.25%麦芽浸粉,1.5%KNO3,0.2%NaCl,0.1% CMC-Na。此时,CMCA、FPA和BGL分别为111.710 U/mL、35.017 U/mL和116.799 U/mL,较菌株培养44 h时的酶活分别提高了8.78%、387.23%和700.38%。
3讨论
利用刚果红平板法初筛得到的透明圈比值大的菌株,其酶活并不一定高。试验中我们发现菌株B-1的透明圈比值高达6.167,而菌株B-12的透明圈比值仅为2.083,但从摇瓶发酵复筛结果看,菌株B-12的酶活要高于B-1的。因此,在筛选纤维素酶高产菌株时,摇瓶发酵复筛是必要的。
我们首次从马铃薯瓢虫肠道中分离得到多株产纤维素酶肠道菌并筛选到1株酶活性较高的菌株B-12,产酶条件经优化后,其CMCA为111.710 U/mL,FPA为35.017 U/mL,BGL为116.799 U/mL。而采用同样的酶活测试方法,林祥木等[17]从土壤中分离得到的最好的菌株其CMCA为36 U/mL,FPA为31 U/mL,BGL不足41 U/mL。昆虫是地球生物圈中已知种类最多的一群生物[18,19],昆虫种类、数量及分布范围的多样性意味着昆虫肠道菌的多样性[20]。研究表明昆虫肠道菌是微生物新种的潜在资源[21,22]。因此,昆虫肠道菌可能是新高产纤维素酶的广泛来源,而从昆虫肠道菌分离产纤维素酶菌还鲜有报道,亟待研究开发。
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