单位文秘网 2021-08-18 08:56:33 点击: 次
摘要:利用选择培养基对茂名市郊区种植的成熟小白菜植株进行内生菌分离,共得到3株内生细菌、5株内生真菌、2株内生放线菌。细菌分属芽孢杆菌属、埃希氏菌属、黄色杆菌属,真菌主要为曲霉属、毛霉属,放线菌分属链霉菌属和诺卡菌属。利用平板对峙培养法筛选出2株内生放线菌及1株内生细菌对植物菌核病菌有强拮抗作用。
关键词:小白菜;内生菌;菌核菌;拮抗菌
中图分类号:S476+.19文献标识码:A文章编号:0439-8114(2011)13-2676-04
Isolation of Endophyte and Screening for Sclerotia Antagonistic Bacteria in Pakchoi
LIU Jie-feng,ZHOU Tian,WANG Ying,HAN Han-bing
(College of Chemistry and Life Science, Maoming University,Maoming 525000,Guangdong,China)
Abstract: Three endophytic bacterial strains, five fungi strains and two actinomyces strains were separated from mature pakchoi plants collected from Maoming suburb by selective media. These strains were preliminarily classified asBacillus Cohn, Flavobacterium, Escherichia Castellani, Aspergillus, Mucor, Streptomyces and Nocardia. Among the eight isolated genera, two actinomyces strains and one bacterial strain had strong antagonism against Sclerotinia sclerotiorum confront antibiotic culture.
Key words: pakchoi; endophyte; Sclerotia bacteria; antagonism
植物内生菌是指整个生活史或生活史的某一阶段生长在植物组织细胞间隙或细胞内而不引起明显病害症状的微生物。植物内生菌是一个多样性十分丰富的微生物类群,大量研究结果表明,内生菌在植物体内占据有利于生防的生态位,具有抗病虫害[1-4]、植物促长[5,6]、增强宿主抗逆境[7]等功能。近年来,植物内生菌的生理作用[8-12]及其作为潜在的生防资源[13-15]已逐渐成为国内外研究的热点。
小白菜是蔬菜中含矿物质和维生素最丰富的蔬菜,在我国南方广泛种植。小白菜富含抗过敏的维生素A、维生素C、维生素B族、钾、硒等,小白菜有利于预防心血管疾病,降低患癌症危险性,并能通肠利胃,促进肠管蠕动,保持大便通畅,还能健脾利尿,促进吸收,而且有助于荨麻疹的消退等功效。
蔬菜菌核病是一种由菌核菌[Sclerotinia sclerotiornm(Lib)de Bary]感染,寄主广泛,难以防治,对生产有严重损失的作物病害。随着生活水平的提高和环保意识的增强,人们对自身健康的关注和对无公害食品要求也越来越高。因此,农作物的低污染生物防治将逐步部分或全部替代化学药物防治,其中通过植物内生菌的生物防治更是人们关注的焦点。国内外学者在油菜、柑橘、瓜类等果蔬的菌核病生物防治方面开展了广泛研究,并取得了一定成效,但是对生长期短的蔬菜菌核病生防研究则少见报道。
在对茄类内生菌分离及拮抗菌筛选工作的基础上[16],本试验对茂名市郊区大面积种植的小白菜的内生菌进行分离,并对常见病原菌核菌的拮抗内生菌进行筛选,目的在于探索新的防治植物菌核菌病的有效途径,为提高本地区蔬菜的质量提供基础理论数据。
1材料与方法
1.1供试材料
健康的小白菜采自茂名郊区菜园。病原菌为从染病的小白菜根茎叶中分离得到。
1.2培养基
1)牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏0.5%,蛋白胨1.0%,NaCl 0.5%,琼脂1.5%~2.0%,pH值7.4。加入50 mg/L重铬酸钾抑制真菌生长。
2)高氏Ⅰ号培养基:可溶性淀粉2.0%,KNO3 0.1%,K2HPO4·3H2O 0.05%,NaCl 0.05%,MgSO4·7H2O 0.05%,FeSO4·7H2O 0.001%,琼脂1.5%~2.0%。pH 值7.4。加入50 mg/L重铬酸钾抑制真菌生长。
3)马铃薯培养基(PDA):马铃薯浸出液20%,蔗糖2%,琼脂1.5%~2.0%,自然pH值。加入250 U/L的氨苄青霉素抑制细菌生长。
4)拮抗试验培养基:牛肉膏蛋白胨培养基,加入20%的小白菜研磨浸出液。液体培养不加琼脂。
以上培养基均在121 ℃灭菌20 min。
1.3内生菌及供试菌的分离与纯化
1.3.1内生菌的分离与纯化采回的植株用流水冲洗干净,剪成小段,75%酒精中浸泡3 min,再用10%次氯酸钠浸泡一定时间:茎为8 min,根和叶由于气孔较茎大,浸泡5 min即可,然后用无菌水浸泡多次,每次3 min,表面消毒检测至漂洗液无菌落长出为止,一般为3~4次。在无菌条件下用适量的PBS缓冲液捣碎,充分搅拌后静置3 min,取上清液0.5 mL分别涂布于分离培养基平板上,每种材料做3次平行,以最后一次的漂洗液作对照,30 ℃下培养一个星期。挑取不同形态的菌落,平板划线进行3~4次的传代纯化、镜检、斜面低温保存。
1.3.2病原菌核菌的分离选取具有明显菌核菌病症的小白菜,采用常规组织分离方法从长菌丝及菌核处取样,接种于PDA培养基中(添加10%的
1/3 000孟加拉红溶液),30 ℃培养至长出白色菌丝后,取白色菌丝进行多次划线纯化至纯种,斜面低温保存。
1.4内生拮抗菌的筛选与活性测定
把分离得到的内生菌与菌核菌分别于牛肉膏蛋白胨培养基中连续活化3次,每次间隔24 h,使菌株处于生长旺盛期。把内生菌接种于平板培养基的一侧,于相隔2 cm的培养基上接种菌核菌。30 ℃培养,以不接供试菌为对照,24 h后观察。
对菌核菌有拮抗作用的内生菌进行液体培养,细菌培养48 h,真菌或放线菌培养6 d,发酵液过滤除菌后,按20%浓度混合到平板培养基中,接种菌核菌30 ℃培养,以不加发酵液作对照,24 h后观察。
1.5菌株的鉴定
1)内生菌鉴定:根据分离菌的培养特性及菌体菌落形态特征、银盐染色、革兰氏染色及生理生化反应等,参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版及《真菌鉴定手册》对分离得到的内生菌株进行鉴定分类。
2)病原菌鉴定:根据分离菌在PDA培养基上的菌落和菌核形成等培养性状特征,结合柯赫准则及文献[17]对染菌核病植株特征的描述,确定病原菌种属。
2结果与分析
2.1内生菌的分离结果
采用研磨液培养法,利用选择培养基对健康的小白菜植株进行内生菌分离,平板划线法纯化,得到内生菌在不同组织中的定殖情况见表1。共得到菌落形态不同的3株内生细菌、5株内生真菌、2株内生放线菌,编号见表2,其中xbc-b①、xbc-f①、xbc-f③在小白菜的根、茎、叶均有分布。实验结果表明,由于各植物的器官所处生态位不同,导致同种植株不同的部位侵染的内生菌种类及数量均有差异,小白菜中根部分离得到的内生菌相对较多,内生菌种类中真菌的分离几率最大。可见,小白菜中的内生菌主要由土壤或由种子传导。
2.2内生菌及病原菌的鉴定
2.2.1内生菌参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版及《真菌鉴定手册》,依据菌体和菌落的形态、鞭毛有无、革兰氏染色、生理生化反应等,对10株内生菌进行初步鉴定分类,结果见表2。
2.2.2病原菌
1)菌落特征:在PDA培养基上菌落白色,放射状生长,疏松,紧贴于培养基的表面,圆形,边缘整齐,24 h后扩散到整个培养皿。
2)菌丝形态:显微镜下可见菌丝无色、分枝直角、有横隔,后期能相互扭集成小白点,再形成菌核。
3)菌核特征:初形成的菌核乳白色,后转为淡黄色,最后茶褐色,表面光滑,球形或椭圆形,有时2~4个菌核相互粘连在一起,培养基上菌核直径0.5~1.0 mm。
4)致病性:用刺伤法把病原菌纯种的菌丝块和菌核接种于健康小白菜茎上,植株接种菌丝2~3 d后茎基部淡褐色并被白色绢丝状菌丝包围,接种菌核的植株5 d后也出现同样症状,6~8 d后植株茎基部腐烂倒伏,全株死亡,而对照没发病。
根据上述致病性特点、病原菌形态和培养性状,分离到的病原菌与文献[12]对白绢病病菌及其所致病害症状的描述,初步鉴定为罗氏白绢小菌核菌(Sclrotium rilfsii Accardo)。
2.3菌核菌的抑制试验结果
把分离、纯化的10株内生菌分别与罗氏白绢小菌核菌进行对峙试验,部分结果如图1、2、3、4。
试验结果表明,10株内生菌中有2株放线菌和1株细菌对罗氏白绢小菌核菌有较强的抑制作用,病原拮抗菌分别为:链霉菌属(Streptomyces)、诺卡菌属(Nocardia)、芽孢杆菌属(Bacillus)。
病原菌核菌在3种分别含3株拮抗内生菌发酵液的平板培养基中的生长情况显示,病原菌核菌在诺卡菌发酵液培养中生长良好,受抑制作用不明显,而在另2种内生菌发酵液培养基生长均受到抑制,菌落出现较晚,菌丝明显减少。表明诺卡菌属菌株对菌核菌的抑制作用可能是由营养或空间引起的竞争抑制,而链霉菌属和芽孢杆菌属两株内生菌的抑制作用主要是其代谢产物的影响。
3结论
1)利用牛肉膏蛋白胨培养基、高氏Ⅰ号培养基和马铃薯培养基3种培养基外加抑制剂对小白菜植株的根、茎、叶进行内生菌分离,共得到3株内生细菌、5株内生真菌、2株内生放线菌。
2)用平板对峙培养法进行内生拮抗菌的筛选结果表明,分离得到的10株内生菌中有2株放线菌和1株细菌对菌核病原菌有较强的拮抗作用,其中的2株内生菌可能是由其代谢产物引起的抑制。
3)通过菌落及菌体的形态特征、鞭毛有无、革兰氏染色、生理生化反应等方法对10株内生菌进行初步鉴定归属,细菌分别为芽孢杆菌属、埃希氏菌属、黄杆菌属;真菌主要为曲霉属和毛霉属,放线菌为链霉菌属和诺卡菌属。通过菌落和菌核形成等培养性状特征,结合柯赫准则对病原菌初步鉴定为罗氏白绢小菌核菌(Sclrotium rilfsii Accardo)。内生菌中对菌核菌有拮抗作用的是链霉菌属(Streptomyces)、诺卡菌属(Nocardia)、芽孢杆菌属(Bacillus)。
参考文献:
[1] 孙力军,陆兆新,别小妹,等. 1株抗菌植物内生菌EJH-2菌株的分离和鉴定[J]. 微生物学杂志,2006,18(1):23-26.
[2] BENHAMOU N,KLOEPPER J W,QUADT-HALLMANN,et al.Induction of defense-related ultrastructural modifications in pea root tissues inoculated with endophytic bacteria[J].Plant Physiology,1996,1123:919-929.
[3] VEGA F E. Insect pathology and fungal endophytes[J]. Journal of Invertebrate Pathology,2008,98(3):277-279.
[4] LIU B,QIAO H P,HUANG L L,et al. Biological control of take-all in wheat by endophytic Bacillus subtilis E1R-j and potential mode of action[J]. Biological Control,2009,49(3): 277-285.
[5] NELE W,SASCHA T,JOKE D,et al. Potential of the TCE-degrading endophyte Pseudomonas putida W619-TCE to improve plant growth and reduce TCE phytotoxicity and evapotranspiration in poplar cuttings[J]. Environmental Pollution, 2010,158(9):2915-2919.
[6] LILIANA H C,SERGIO O,JOHN B. Growth stimulation in bean(Phaseolus vulgaris L.) by Trichoderma[J]. Biological Control,2009,51(3):409-416.
[7] NELE W,SARAH C,JOKE D,et al. Endophytic bacteria improve phytoremediation of Ni and TCE co-contamination[J].Environmental Pollution,2010,158(7):2422-2427.
[8] 贾栗,陈疏影,翟永功,等.近年国内外植物内生菌产生物活性物质的研究进展[J].中草药,2007,38(11):1750-1754.
[9] LU H,ZOU W X,MENG J C,et al. New bioactive metabolites produced by Colletotrichum sp., an endophytic fungus in Artemisia annua[J]. Plant Science,2000,151(1):67-73.
[10] 张玲琪,王海昆,邵华,等.美登木内生真菌产抗癌物质球毛壳甲素的分离及鉴定[J].中国药学杂志,2002,7(3):172-175.
[11] 李桂玲,王建锋,黄耀坚,等.植物内生真菌抗肿瘤活性菌株的筛选[J].菌物系统,2001,20(3):387-391.
[12] 姜广策,林永成,周世宁,等.中国南海红树内生真菌No.1403次级代谢物的研究[J].中山大学学报(自然科学版),2000,39(6):68-72.
[13] 史应武,娄恺,李春.植物内生菌在生物防治中的应用[J].微生物学杂志,2009,29(6):61-64.
[14] PAUL A B, RICHARD A S. Endophytes: An emerging tool for biological control[J]. Biological Control,2008,46(1):1-3.
[15] YU H S, ZHANG L, LI L, et al. Recent developments and future prospects of antimicrobial metabolites produced by endophytes[J].Microbiological Research, 2010,165(6):437-449.
[16] 刘杰凤,韩寒冰,张进凤,等.茄类内生菌的分离及拮抗细菌的筛选[J].安徽农业科学,2009,37(3):1160-1162.
[17] 黄根深,刘爱勤,张翠玲.香草兰白绢病的初步研究[J].热带作物学报,1999,20(4):49-52.
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