单位文秘网 2021-08-13 09:10:51 点击: 次
组织表面,然后释放出各种毒素及酶,对机体造成伤害。而实现黏附目的的组分位于金黄色葡萄球菌表面,称之为黏附素(adhesin)。黏附素是一类蛋白质,包括纤黏蛋白原凝集素A、B(FibrinogenbindingproteinsclumpingfactorAandB,ClfA,CIfB)、纤黏蛋白A、B(fibronectinbindingproteinsAandB,FnBPA,FnBPB)、胶原结合蛋白(collagenbindingprotein,Can)和A蛋白(proteinA)等 [20]。ClfA是金黄色葡萄球菌重要的黏附素之一,编码ClfA的基因clfA,在迄今为止所有临床分离的金黄色葡萄球菌中都存在,因此,以黏附素ClfA为靶位进行疫苗研制是预防和治疗金黄色葡萄球菌感染的有效选择 [19]。
笔者以评价前期构建的表达金黄色葡萄球菌黏附素ClfA的重组乳酸乳球菌MG1363/pMG36c-clfA菌株的异常毒性为目的,为下一步制备基因工程黏膜免疫活载体疫苗、新型免疫型微生态制剂奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验动物。ICR系清洁级小白鼠,雌性,18~22g,购自黑龙江省中医药大学实验动物中心,共计40只,分为4组,每组10只。
1.1.2菌株。重组乳酸乳球菌(MG1363/pMG36cclfA)由黑龙江省科学院微生物研究所应用医学微生物研究室构建。
1.1.3培养基。MRS肉汤培养基,购自广东环凯微生物科技有限公司。
1.1.4主要仪器设备。独立送风隔离笼具,超净工作台,细菌麦氏比浊仪,恒温培养箱。
1.2方法
1.2.1重组乳酸乳球菌增菌培养。将重组乳酸乳球菌(MG1363/pMG36cclfA)接种于MRS肉汤培养基中,30℃静止培养28h。
1.2.2重组乳酸乳球菌标准浓度菌液制备。将重组乳酸乳球菌培养物4℃、4000r/min离心20min,收集沉淀,用100ml0.9%氯化钠注射液洗涤3次,沉淀溶于50ml0.9%氯化钠注射液中,用细菌麦氏比浊仪精确校正菌液浓度4.0×10 4、2.0×10 7、1.0×10 8CFU/ml(以0.9%氯化钠注射液为标准空白溶液)。
1.2.3异常毒性试验。随机将40只小鼠分为4组,即对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组,每组10只,每只小鼠试验前编号、标记、称重。高剂量组给1.0×10 8CFU/ml重组乳酸乳球菌氯化钠混悬液0.5ml,中剂量组给2.0×10 7CFU/ml重组乳酸乳球菌氯化钠混悬液0.5ml,低剂量组给4.0×10 4CFU/ml重组乳酸乳球菌氯化钠混悬液0.5ml,对照组给0.9%氯化钠注射液0.5ml,全部试验组均一次性腹腔注射给药,观察给药后0~7d小鼠的存活及健康情况,7d后试验结束,每只小鼠称重,记录结果。
1.3数据处理
试验数据用简明统计软件计算,以平均值±标准差表示。
2结果与分析
小鼠腹腔注射给药后,对照组及高、中、低剂量组小鼠全部健存,皮肤、毛色和活动均无异常反应,7d后,每只小鼠体重均较给药前增加,高、中、低剂量组小鼠体重增加量和增加率与对照组小鼠相比无显著性差异(表1)。
3讨论
疫苗以技术水平划分,可分为第一代完整病原体疫苗(减毒的活疫苗及灭活疫苗)、第二代分子技术亚单位疫苗和第三代基因工程疫苗 [19]。部分第一代、第二代疫苗免疫效果不明显,且在激发机体免疫反应之前有降解的可能性,使其应用受到了限制 [21-24]。目前,第三代基因工程疫苗是疫苗研发中的重点,而黏膜免疫活载体疫苗作为基因工程疫苗中非常重要的一类,由于其可在黏膜表面接种激发作为机体第一道屏障的黏膜免疫以阻止病原微生物的入侵,故成为基因工程疫苗研发中的热点 [25]。
目前活载体疫苗研究最多的是致弱病原菌载体,如分枝杆菌(mycobacteria) [26]、沙门氏菌(salmonlla) [27]。但因其仍可能保持侵袭性和毒性,对儿童、老人及部分免疫缺陷者有潜在的危险,此外,过强的免疫应答会降低后继疫苗的效力,因此,其在应用上受到了限制。
利用乳酸乳球菌作为抗原递呈载体能够克服上述缺陷。乳酸乳球菌是安全级的微生物,在基因工程活载体疫苗的研发上具有很多天然的优势:首先,它不是人和动物肠道内固有菌,不会在肠道内定居,免疫原性小,不会造成免疫麻痹,可重复免疫;其次,乳酸乳球菌自身携带多种成分可参与免疫修饰,可作为佐剂激活机体的免疫系统,激发体液及细胞免疫;第三,乳酸乳球菌分泌蛋白较少,且不分泌胞外蛋白酶,因此,表达的外源蛋白易于纯化且能保持天然的活性;最后,乳酸乳球菌易于驯化,相关表达系统的构建技术比较成熟 [28]。
该研究对前期构建的表达金黄色葡萄球菌纤黏蛋白原凝集素A(ClfA)的重组乳酸乳球菌MG1363/pMG36c-clfA菌株进行异常毒性的评价研究。该研究设置了高、中、低剂量组,分别腹腔注射1.0×10 8、2.0×10 7、4.0×10 4CFU/ml重组乳酸乳球菌氯化钠混悬液0.5ml,相当于人体每天建议用量的2500、500和1倍。结果表明,重组乳酸乳球菌MG1363/pMG36c-clfA菌株对动物体无明显可见的异常毒性作用。重组乳酸乳球菌在制备基因工程活载体疫苗和新型免疫型微生态制剂方面具有十分广阔的应用前景。
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