单位文秘网 2021-07-09 08:21:20 点击: 次
打开文本图片集
摘要:在建立单重PCR的基础上成功建立了多种二重PCR体系,以同时检测2种肉源成分(猪、牛、鸡和羊)。PCR扩增的是每种动物的线粒体基因,由于鸡、羊的PCR扩增片段大小过于接近(131和119 bp),电泳图上不易区分,故试验中的二重PCR体系使用了5种动物组合。所建立的二重PCR方法能够迅速、稳定地同时鉴别2种肉源性成分,为下一步建立三重或四重PCR方法奠定了良好的基础。
关键词:肉类掺假;二重PCR;线粒体DNA;肉源检测
中图分类号:TS251.7 文献标志码:A doi:10.16693/j.cnki.1671-9646(X).2019.01.049
Detection of Meat-derived Components in Meat Products by Diplex PCR
LI Huijie,JIANG Huimin,JIA Xiaotong,LI Xiaoyan,WANG Li"na,YIN Haoyue,*LI You
(College of Life Sciences and Engineering,Northwest University for Nationalities,Lanzhou,Gansu 730124,China)
Abstract:In the current study,multiple diplex PCR systems were developed in order to simultaneously detect two animal DNA derived from pork,beef,sheep or chicken. The diplex PCR systems were constructed based on previously designed single PCRs using mitochondrial genes of each animal species. The combination of chicken with sheep was not used in the study since the amplicon sizes of these two animal species were too closely to distinguish(131 and 119 bp). Therefore,the diplex PCRs system used in the experiment used five animal combinations. The diplex PCR procedure standardised in this study is simple,reliable and efficient to detect meat adulteration containing pork,beef,chicken and sheep. The results can also be used to develop multiplex PCR containing three or four of these animal species. The diplex PCR procedure standardised in this study is simple. The results could also be used to develop multiplex PCR containing three or four of these animal species.
Key words:meat adulteration;diplex PCR;mitochondrial DNA;meat species identification
隨着经济的发展,人们的消费水平也逐步提高,消费者对食品的安全性有了更高的要求,在国内及国际贸易中,牛、羊肉中掺杂价格便宜的鼠、猫、兔、猪等肉类,以次充好的欺骗行为屡见不鲜,严重损害了消费者的利益。在穆斯林国家和地区,肉类食品的掺假不仅仅是经济问题,更是宗教问题。在市场中,牛、羊肉中掺杂价格便宜的鼠、猫、兔、猪等肉类,以次充好获取高额利益,加之近年来疯牛病、羊瘙痒症等疾病的出现,肉源性成分的鉴定刻不容缓。随着PCR技术在掺假肉检测中的引入,PCR法、多重PCR法和实时荧光PCR以其高灵敏度和强特异性逐渐成为肉类鉴别的主要分析方法[1-2]。其中,多重PCR法具有反应体系中可扩增出多段目的DNA片段[3]的优势,Tettelin H等人[4]已成功进行了15多对引物的多重PCR。PCR 技术是一种用于体外扩增 DNA 片段的方法,其反应原理类似于 DNA的半保留复制过程,它的特异性表现在与靶序列两端互补的核苷酸引物上。人为地给试管中的待扩增目标 DNA 样品提供合适的环境条件,如模板 DNA、核苷酸引物、DNA 聚合酶和合适的缓冲液体系等反应所需物质,通过控制反应液温度和反应时间实现 DNA 变性、退火及延伸3个基本过程,然后重复3个反应过程,在若干循环后实现 DNA 片段呈指数倍扩增。多重PCR技术[5]就是指在单一PCR技术的基础上进行改进的一种技术,是将多条引物和多条模板混合在一个反应体系中分别特异扩增不同的目的条带,或者多条引物和单一的模板DNA混合在同一反应体系中扩增同一模板的不同片断,常用于对超长片断的扩增。和传统单一的PCR技术相比,多重PCR技术具有高效性、系统性和经济简便的特点。
PCR技术具有上述突出优点,人们将这一技术应用到不同的领域,使之迅速发展,取得了巨大的成果,如从事食品病原菌检测的研究人员将这种技术引入到食品检测领域。近年来,基于反应的基本原理,许多学者对PCR技术进行研究和改进,使之得到进一步完善,并在此基础上派生出了许多新的用途[6]。
1 材料与方法
1.1 材料
在市场上购买生鲜的牛肉、猪肉、鸡肉和羊肉,保存于-4 ℃冰箱中。
1.2 试剂与器材
细胞裂解液、7.8 mol/L醋酸铵,异丙醇,1X TEL,Buffer TE,70%乙醇,dNTPS(2.5 mmol/L),琼脂糖,蛋白酶K(100 μg/mL),细胞裂解缓冲液,SDS 10%,胰RNA酶 20 μg/mL,TE缓冲液(pH值8.0),酚,氯仿,异戊醇(25∶24∶1),冷无水乙醇,高压灭菌锅,以及PCR相關试剂(Premix Taq Version2.0,Takara,500 μL)、PCR仪(MyGeneTML Series Peltire Thermal Cycler)和电泳仪(琼脂糖水平电泳)。
1.3 试验步骤[7-21]
1.3.1 二重PCR反应体系建立
(1)DNA提取。运用Gentra Puregene Extraction Kit(Gentra Systems Inc.)提供的方法提取肉制品混合物DNA,提取的DNA保存在TE溶液里,作为PCR反应的模板。用紫外分分光度计测试DNA浓度。
(2)引物设计。从文献里分别查到猪(Cytb)、牛(Cytb)、鸡(12S rRNA)、羊(Cytb)的引物序列,由Takara公司合成(Takara,中国),保存于-20 ℃冰箱中。
(3)单重 PCR扩增。
单重PCR中不同动物扩增的目的基因名称与大小、扩增的引物序列、长度和退火递度详见表1,单重PCR反应体系详见表2,单重PCR反应程序详见表3。
1.3.2 二重PCR反应体系的优化
按照扩增的目标基因大小,将4种动物两两组合,即猪牛、牛鸡、牛羊、猪鸡,猪羊。由于鸡和羊大小近似,不容易区别,因此二重PCR不考虑鸡羊组合。
为获得最佳的二重PCR反应体系,首先尝试了不同的引物浓度、DNA浓度和Premix Taq的浓度,具体PCR反应体系如下:
(1)2种动物的上、下游引物各为1 μL,Premix Taq 12.0 μL,2种模板DNA 各加3.5 μL,ddH2O 2 μL,体系总体积为25.0 μL。
(2)2种动物的上、下游引物各为1 μL,Premix Taq 12.0 μL,2种模板DNA各加6.0 μL,ddH2O 2 μL,体系总体积为30.0 μL。
(3)2种动物的上、下游引物各为1 μL,Premix Taq 12.0 μL,2种模板DNA 各加3.0 μL,ddH2O 3 μL,体系总体积为25.0 μL。
(4)2种动物的上、下游引物各为0.5 μL,Premix Taq 12.5 μL,2种模板DNA 各加3.0 μL,ddH2O 4.5 μL,体系总体积为25.0 μL。
(5)2种动物的上、下游引物各为0.5 μL,Premix Taq 12.0 μL,2种模板DNA 各加3.0 μL,ddH2O 5 μL,体系总体积为25.0 μL。
同时为获得二重PCR中不同引物组合的最佳退火温度,试验中为每组引物设置55~64 ℃的温度梯度,因此每组动物需要10个重复,为避免加样时试剂的损失,配置Mastermix时按照12个样本量的试剂量加样。
最佳退火温度的确立——二重PCR反应体系见表2。
2 结果与分析
2.1 二重PCR反应体系建立结果
经电泳结果检测得出,猪、牛、鸡和羊的PCR扩增片段大小分别为204,472,131,119 bp。由于鸡和羊的扩增片段大小过于接近(131和119bp),电泳图上不易区分,因此试验中的二重PCR体系使用了5种动物组合,分别为牛和猪、牛和鸡、牛和羊、猪和鸡、猪和羊。最终确立的二重PCR为25 μL体系,包含12.5 μL的Premix Taq,每条引物0.4 μmol/L,以及每种动物DNA 3~4 μL。二重PCR反应条件为预变性94 ℃ 3 min,35个循环:94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s;延伸72 ℃ 5 min。
2.2 二重PCR体系优化结果
猪羊、猪鸡二重PCR结果见图1。
图1左侧中从上到下,分别是500 bp Marker、猪羊模板DNA 1~8、1 000 bp Marker。从图中清楚可见猪羊模板DNA 1~3均出现了2条不同的明亮条带,说明这3个猪羊DNA扩增较为成功。猪羊模板DNA 4~8均没有出现条带。图中扩增的8个猪羊DNA模板,有3个扩增成功,说明在上述反应体系下扩增,猪羊的二重PCR扩增成功的概率较高,该反应体系可以用于扩增猪羊DNA。
图1右下侧中从上到下,分别是1 000 bp Marker、猪鸡模板DNA 1~6。其中,猪鸡模板DNA1~2出现 2条明显不同的条带,图中6个猪鸡模板,有2个扩增成功,说明该反应体系可以用于研究扩增猪鸡DNA。
鸡羊DNA二重PCR结果见图2。
图2中所有的1 000 bp Marker 与500 bp Marker 跑的效果均较好,说明胶片制作效果较好。图2左侧为鸡DNA的扩增结果,DNA条带明亮位于1 000 bp Marker的100~200 bp,位于500 bp Marker的100~ 150 bp,可以判断出鸡扩增长度为120 bp左右。图2右侧为羊DNA的扩增结果,DNA条带明亮位于1 000 bp Marker的100~200 bp,位于500 bp Marker的100~ 150 bp,可以判断出鸡扩增长度为130 bp左右。
猪牛DNA,鸡牛DNA,牛羊DNA二重扩增结果见图3。
图3中所有的1 000 bp Marker与500 bp Marker 跑得效果均较好,说明胶片制作效果较好。图3左侧为猪牛DNA扩增的DNA条带,从上到下分别为猪牛DNA 1~9,其中猪牛DNA 1~5均只有1条DNA条带,说明这5个的猪牛DNA扩增失败;猪牛DNA 6~9均有2条明亮的DNA条带,说明这4个DNA在该反应体系下扩增较为成功。图3右上为牛羊DNA扩增的条带,从上到下分别为牛羊DNA 1~4,这4个DNA均扩增出了2条明亮的DNA条带,说明在上述反应体系下扩增较为成功。图3右下为鸡牛DNA扩增条带,从上到下分别为鸡牛DNA 1~5,这5个DNA均扩增出了2条明亮的DNA条带,说明在此反应体系下扩增较为成功。
5种动物的二重PCR结果见图4。
3 结论
运用单重PCR技术扩增牛、猪、鸡、羊的DNA,并对每个样品做梯度PCR,以寻找各对引物最接近的适宜的退火温度,为后期二重PCR试验做准备。猪、牛、鸡、羊的退火温度范围接近,由于鸡羊目的条带大小十分相同,在电泳图上不易于区分,因此在二重PCR时不考虑作为模板DNA。
在二重PCR中通过对PCR反应体系的优化,尤其是针对6种不同的动物模版组合(牛猪、牛鸡、牛羊、猪鸡、猪羊、鸡羊),设置退火温度梯度55~64 ℃范围后,对6种二重PCR的电泳图进行了比较,最终确立了55 ℃为最佳退火温度。并且6种动物模版组合中,由于鸡羊组合的目标条带大小近似(119 bp和131 bp),电泳图上不宜区分,因此最终选择了5种二重PCR:牛猪、牛鸡、牛羊、猪鸡、猪羊,其反应体系均为25 μL总体积,上下引物各 1 μL,模版DNA 3~4 μL,Premix Taq 12.5 μL。反应条件为预变性94 ℃3 min,35个循环:94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s;延伸72 ℃ 5 min。
引物特异性和融合温度在多重PCR试验中是非常关键的,因其成功取决于在单重PCR条件下引物与其各自靶标选择性退火的能力,包括反应体系、循环次数和退火温度。故引物设计是PCR发展中十分重要的一步,需包含足够的种内保守序列和密切相关的Tm的种间多态性。
快速检测出更多肉品的种类和掺假,仍然是我国学者研究的重点对象,运用多重PCR方法似乎是最为快速的一种方式,它具有极高的准确性,为此希望通过该方法建立一种快速、高效和同时检测肉制品中多种肉源性成分的方法,为肉类掺假提供更为有利的证据。
参考文献:
张娟,宗卉,张利平. PCR-mtDNA 技术鉴别检测不同动物肌肉组织和饲料中鸭源性成分[J]. 生物工程学报,2008,24(10):1 832-1 836.
李通,尹艳,王海,等. 聚合酶链式反应快速鉴别5种常见肉类别[J]. 食品科学,2013,34(8):249-252.
张玉霞,黄鸣. 食品检验中多重PCR技术的应用[J]. 中国卫生检验杂志,2008(5):25-30.
Tettelin H,Rradune D,Kasif S. Optimized Multiplex PCR:efficiendy closing a whole-genome shotgun sequencingproject[J]. Genonfics,1999,62(3):500-507.
江飞,张旭伟. PCR技术在食品检测中的应用和发展[J]. 河南农业,2017(6):56-58.
陈枝楠,卢泽,高卢俭. PCR应用技术进展簡介[J]. 植物病理学报,1997(3):7-9.
侯东军,杨红菊,姜艳彬,等 . 利用 PCR 技术鉴定牛羊肉中搀杂猪肉的方法研究[J]. 宁波农业科技,2009(3):5-9.
牛春华,赵玉娟,高磊,等. 一种产耐热蛋白酶假单胞菌双重PCR检测方法的建立[J]. 农产品加工,2015(18):43-46.
侯东军,杨红菊,姜艳彬,等. PCR 技术鉴定牛羊肉中搀杂猪肉的方法建立[J]. 食品工业科技,2009(3):328-329.
冯海永,韩建林. 羊肉产品中若干动物源性成分的七 重 PCR检测技术应用研究[J]. 中国畜牧兽医,2010, 37(9):85-90.
Ali M. E.,Razzak M. A.,Hamid S. B. A. Multiplex PCR in species authentication:Probability and prospects-A review[J]. Food Analytical Methods,2014(10):1 933- 1 949.
Matsunaga T.,Chikuni K.,Tanabe R.,et al. A quick and simple method for the identification of meat species and me-at products by PCR assay[J]. Meat Science,1999(2):143-148.
王丽媛,叶建荣,李兴民,等. PCR 技术检测食品与饲料中动物源成分[J]. 保鲜与加工,2006,6(4):33-36.
陈文柄,邵碧英,廖宪彪,等. 加工食品中若干动物成分的 PCR检测技术应用研究[J]. 食品科学,2005,26(8):338-342.
陈颖,葛毅强. 现代食品分子检测鉴别技术[M]. 北京:中国轻工业出版社,2008:179-180.
郑光明,张国利,周志江,等. 聚合酶链反应(PCR)鉴定马肉方法的建立及应用[J]. 肉品卫生,1997(7):6-8.
Pei Qin,Yeun Hong,Hae-yeong Kim. Multiblex-PCR assay for simultaneous identification of lamb,beef and duck in raw and heat-treated meat mixtures[J]. Journal of Food Safety,2015(36):367-374.
M. Mansoor Bhat,Mir Salahuddin,Imtiyaz A. Mantoo,et al. Species-specific identification of adulteration in cooked mutton Rista(a Kashmiri Wazwan cuisine product)with beef and buffalo meat through multiplex polymerase chain reaction[J]. Veterinary World,2016(3):226-230.
Hou Bo,Meng Xiaong,Zhang Liyuan,et al. Development of a sensitive and specific multiplex PCR method for the simultaneousdetection ofchicken,duckandgoose DNA in meat products[J]. Meat Science,2015(7):90-94.
曹黛丽,陈超,宋平,等. 一种简易的猪肉和牛肉分子生物学鉴别方法研究[J]. 中国农学通报,2009,25(18):110-112.
钟伟军,陈金顶. PCR检测饲料中牛源组织成分的研 究[J]. 华南农业大学学报,2006,27(3):91-94. ◇
(责任编辑:单位文秘网) )地址:https://www.kgf8887.com/show-249-62650-1.html
下一篇:慕尼黑,梦之城
版权声明:
本站由单位文秘网原创策划制作,欢迎订阅或转载,但请注明出处。违者必究。单位文秘网独家运营 版权所有 未经许可不得转载使用