单位文秘网 2021-07-17 14:01:37 点击: 次
[摘要] 目的:筛选适用于分离纯化黄连小檗碱的大孔吸附树脂。方法:本文考察了10种大孔吸附树脂,筛选出了适用于分离纯化黄连小檗碱的D101大孔吸附树脂,其静态吸附量为18.08 mg/g,静态和动态解吸率均为95%以上。结果:选用D101大孔吸附树脂,先水洗除杂,再用4~5倍树脂体积的60%乙醇洗脱,浓缩干燥,产品中小檗碱的含量为30.02%,产品收率为9.12%。结论:本法简单、易行,适合黄连小檗碱的提取。
[关键词] 黄连 小檗碱 分离 纯化
[中图分类号] R284.2[文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2011)02(b)-044-03
Study on separation and purification of berberine in Coptis chinensis by macroporous adsorption resin
XI Guoping, SONG Guobin
(The Medical College of Datong University, Shanxi Province, Datong 037009, China)
[Abstract] Objective: To study on separation and purification of berberine in Coptis chinensis by macroporous adsorption resin. Methods: From the 10 kinds of different macroporous adsorption resins, the D101 resin which the adsorption performance was 18.08 mg/g and the desorption ratio was over 95% was selected to separate the berberine in Coptis chinensis. Results: The desorption ratio of over 95% could be gotten by using 60% ethanol as eluting solvent and 4-5 BV. Under these experiment conditions, the content of berberine in products was 30.02% and the yield was 9.12%. Conclusion: The method is easy, possessed of popularization and application value. It can be used for separation berberine from Coptis chinensis.
[Key words] Coptis chinensis; Berberine; Separation; Purification
黄连为毛茛科多年生草本植物,主要分布于川、黔、滇、鄂等省高寒阴暗潮湿的局部山区,为我国西南部著名的中药材[1]。黄连根茎主要含有小檗碱,其次为黄连碱、甲基黄连碱、药根碱等,由于结构相似,统称为黄连生物碱[2]。小檗碱有明显抗心律失常、降血糖、抗肿瘤等重要作用[3]。本文采用孔径、极性等有显著性差异,广泛应用于中草药化学成分分离与富集[4],选择吸附性较好的大孔吸附树脂对黄连小檗碱进行分离纯化研究。
1 仪器与试药
黄连,购于贵阳市花溪区中西药结合第四药店,经鉴定为毛茛科植物黄连;盐酸小檗碱标准品,中国药品生物制品检定所;大孔吸附树脂,天津南开大学化工厂;FA1004电子天平,青岛扬中仪器有限公司;UNICO UV-2000型紫外-可见分光光度计,上海肯强仪器有限公司;RE-200型旋转蒸发仪,上海科兴仪器有限公司;KS康氏振荡器,上海圣科仪器设备有限公司;LGJ-10 冷冻干燥机,河南兄弟仪器设备有限公司。
2 方法与结果
2.1 方法
2.1.1 黄连的前处理
将黄连放入50℃烘箱中烘烤变脆,粉碎,放入冰箱保存。
2.1.2 黄连小檗碱浸出液的制备
称取适量处理好的黄连,用9倍体积60%乙醇(W/V),60℃回流提取2次,每次提取1 h,合并提取液,50℃减压浓缩,备用。
2.1.3 大孔吸附树脂柱层析
2.1.3.1 树脂的预处理树脂先用蒸馏水浸泡24 h,充分溶胀,滤去浮在表面的树脂颗粒,然后用4 mol/L的NaOH浸泡12 h,用蒸馏水洗至中性;再用4 mol/L的HCl浸泡12 h,用蒸馏水洗至中性;最后用乙醇浸泡6 h,再用水洗至无醇味,备用。
2.1.3.2层析分离纯化将浸出液用60%乙醇配制成浓度约为3.5 mg/ml的黄连小檗碱提取液,过滤,上样,洗脱,收集洗脱液,浓缩,冷冻干燥得产品。
2.1.4 黄连小檗碱测定方法
采用分光光度法,以盐酸小檗碱为标准品,准确配制3、6、9、12、15、18 μg/ml标准溶液,于345 nm波长处测定吸光度,由最小二乘法得浓度与吸光度标准曲线方程,并根据此方程计算黄连小檗碱含量[5-6]。
2.2 结果
2.2.1 标准曲线方程
根据“2.1.2”结果,用最小二乘法作线性回归,得盐酸小檗碱浓度C(μg/ml)与吸光度A的关系:A=0.05 491C-0.031 42(r=0.999 9)。
2.2.2 树脂吸附量的测定
称取不同型号树脂10份(已处理),每份5 g,置于具塞三角瓶中,各加入30 ml浓度为3.44 mg/ml的黄连小檗碱提取液,振荡20 h,振荡频率为240次/min。振荡后,滤过,测定滤液中黄连小檗碱浓度,计算各树脂吸附量(mg/g),结果见表1。
式中Q为吸附量,C0为起始浓度,CR 为剩余浓度,V为溶液体积,W 为树脂重量。
表 1 不同树脂对黄连小檗碱的吸附量
Tab.1 Berberine absorption performance of different resins
从表1可见,在设定实验条件下, D101、X-5、NKA-2、H103大孔吸附树脂对黄连小檗碱的吸附量较高。
2.2.3 解吸率的测定
选择“2.2.2”筛选出的4种树脂,每种树脂称取4份,每份5 g,按照“2.2.2”方法吸附,滤过,风干,在滤出树脂中分别加入30 ml浓度为30%、50%、70%、90%的乙醇,按“2.2.2”振荡条件,振荡10 h,过滤,测定滤液中黄连小檗碱浓度,计算解吸率(%)。结果见图1。
图 1 不同解吸剂对小檗碱解吸率
Fig.1Desorption ratio of berberine under different eluting solvent
结果表明,D101大孔吸附树脂的解吸率最高,70%乙醇在所考察溶剂中对黄连小檗碱解吸能力最强。
2.2.4 不同洗脱剂的洗脱结果
称取D101大孔吸附树脂9份(已处理),每份30 g,分别装柱,量取30 ml浓度为3.52 mg/ml的黄连小檗碱提取液,上样,分别用浓度为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇洗脱,流速为2 ml/min,至流出液无色,收集洗脱液,浓缩,60%乙醇定容至50 ml,测定黄连小檗碱含量。见图2。
图 2 不同浓度乙醇的洗脱能力
Fig.2 Elution capacity of different concentrations of ethanol
结果表明,60%乙醇对黄连小檗碱洗脱率最高。
综合“2.2.3”和“2.2.4”实验结果:D101大孔吸附树脂静态吸附量为18.08 mg/g,静态及动态解吸率均为95%以上,为所考察树脂中最好的。
2.2.5 树脂吸附-解吸影响因素
2.2.5.1 pH的影响称取D101大孔吸附树脂5份(已处理),每份5 g,于具塞三角瓶中,各加入30 ml浓度为3.42 mg/ml的黄连小檗碱提取液,用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl溶液将各提取液分别调至设定的pH值,按“2.2.2”振荡条件,振荡20 h,滤过,测定滤液中黄连小檗碱浓度,计算吸附量(mg/g)。见图3。
图 3 pH值对吸附的影响
Fig.3 Effect of pH on adsorption
结果表明,D101大孔吸附树脂在酸性环境下对黄连小檗碱的吸附量优于碱性环境。
2.2.5.2 温度对吸附的影响称取D101大孔吸附树脂5份(已处理),每份5 g,于具塞三角瓶中,各加入30 ml浓度为3.46 mg /ml的黄连小檗碱提取液,分别在设定温度下水浴加热,按“2.2.2”振荡条件,每隔10 min振荡30 s,加热时间为2 h。加热后,过滤,60%乙醇定容至50 ml,测定黄连小檗碱浓度。见图4。结果表明,在室温下,树脂的吸附量最高。
2.2.5.3 洗脱剂用量的影响称取D101大孔吸附树脂(已处理)30 g,装柱,量取30 ml浓度为3.55 mg/ml的黄连小檗碱提取液,上样,60%乙醇洗脱,流速为2 ml/min,收集洗脱液,浓缩,测定黄连小檗碱含量。见图5。
图 5 不同洗脱剂用量的洗脱率
Fig.5 Effect of quantity of different eluting solvent on the desorption ratio
结果表明,4倍树脂体积洗脱剂用量时,解吸率已达到95.25%,继续增加洗脱剂用量,洗脱率没有显著增加。
2.2.5.4 洗脱速度的影响称取D101大孔吸附树脂5份(已处理),每份30 g,分别装柱,量取30 ml浓度为3.57 mg/ml的黄连小檗碱提取液,上样,60%乙醇分别以设定流速洗脱,至流出液无色,收集洗脱液,浓缩,测定黄连小檗碱的含量。见图6。结果表明,洗脱率最高时,洗脱速度为2 ml/min。
2.2.5.5 分离纯化后的产品量取100 ml浓度为3.43 mg/ml的黄连小檗碱提取液,上D101大孔吸附树脂柱,依次用水、60%乙醇洗脱,后者用量为4~5倍树脂体积,浓缩洗脱液至干,冷冻干燥后,得产品,结果见表2。
表 2 分离纯化后的产品数据
Tab.2 Data of purified product
3 结论
本文从树脂选用、影响树脂分离纯化的因素出发,对大孔吸附树脂分离纯化黄连小檗碱进行了探讨。实验表明,D101大孔吸附树脂作为分离纯化树脂,先水洗除杂,再用4~5倍树脂体积的60%乙醇洗脱,浓缩洗脱液,冷冻干燥后的产品中黄连小檗碱的含量为30.02%,收率为9.12%。
[参考文献]
[1]毛堂峰,颜谦,方周伯,等.黄连细胞培养物中小檗碱的分离与鉴定[J].生物工程学报,1997,13(3):284-288.
[2]王秀杰.黄连的药理研究及现代应用[J].中国药师,2003,6(6):370.
[3]田智勇,李振国.黄连的研究新进展[J].时珍国医国药,2004,15(10):704-706.
[4]李月,陈莹.大孔吸附树脂分离纯化银杏叶总黄酮的研究[J].化学与生物工程,2009,26(7):55-57.
[5]孙波,张永光.正交法优选黄连中盐酸小檗碱的提取工艺[J].海峡药学,1999,11(2):100-101.
[6]魏英勤,房海燕,袁久荣.影响大孔树脂吸附黄连提取液的因素[J].中国药业,2003,(2):44.
(收稿日期:2010-09-20)
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