单位文秘网 2021-08-19 09:20:26 点击: 次
农业、生物、食品等领域[9]。笔者采用响应曲面法对罗伊氏乳杆菌冷冻干燥保护剂进行了研究,探索最优化的保护剂组分,以提高冻干过程的菌体存活率。
1 材料与方法
1.1 菌种
罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri),由广州市微生物研究所保藏。
1.2 培养基
1.2.1 活化培养基。蛋白胨 1%、牛肉膏 1%、酵母浸粉0.5%、葡萄糖 2%、磷酸氢二钾 0.2%、柠檬酸氢二铵 0.2%、乙酸钠 0.5%、硫酸镁 0.05%、琼脂2%、pH 6.2~6.4。
1.2.2 发酵培养基。蛋白胨 1%、牛肉膏 1%、酵母浸粉1%、葡萄糖 2.5%、磷酸氢二钾 0.2%、柠檬酸氢二铵 0.2%、乙酸钠 0.5%、硫酸镁 0.05%、吐温80 0.1%、pH 6.2~6.4。
1.3 主要试剂
低聚果糖和海藻糖为生化试剂,购自上海生工生物工程技术服务有限公司;脱脂乳粉为食品级,购自新西兰恒天然集团。
1.4 罗伊氏乳杆菌的培养及冻干
取罗伊氏乳杆菌冻存管,接种于活化培养基,37 ℃下厌氧静置培养 12~24 h。挑取具有典型形态的菌落,接种于发酵培养基,37 ℃下厌氧培养 24 h ,5 000 r/min条件下离心10 min,收集菌泥;加入适量生理盐水重新悬浮。在上述菌悬液中,加入不同组别的冻干保护剂,充分搅拌溶解后,取样检测活菌数;然后,分装于西林瓶中,每瓶2 mL,每组5个重复。将各组样品置于-40 ℃冰箱中预冷4 h,然后置于预冷的冷冻干燥机中冷冻干燥16~18 h。冻干过程中观察不同冻干剂组水分升华快慢情况,待全部样品冷冻干燥充分后取出样品,取样进行活菌计数。
1.5 检测方法
采用稀释倒平板法测定乳酸菌菌落总数,具体原理和步骤参考《GB 4789-2010》[10]中乳酸菌菌落总数的测定方法,按照以下公式计算:
Rc(%)=CtC0×100
式中,Rc为冷冻干燥后罗伊氏乳杆菌的存活率,Ct为冷冻干燥后的活菌数,C0为冷冻干燥前的活菌数。
1.6 冷冻干燥保护剂的优化
根据前期的研究结果,选取低聚果糖、脱脂乳粉和海藻糖这3个因子作为研究对象,进行响应面试验,以存活率(Rc)作为试验的响应值,使用Design expert 7.5进行试验设计与数据分析。中心组合试验实际的因素与水平见表1。
2 结果与分析
2.1 响应面试验
响应面试验结果见表2 。对表2中的试验数据进行多元回归分析。方差分析表明,所选模型的F=100.255 9,P<0.000 1说明因变量Rc与全体变量之间的回归关系显著,也即模型回归显著。R2=0.989,说明因变量Rc与全体变量之间的线性关系显著。失拟项F=4.443,P=0.063 7>0.01,差异不显著,说明试验预测值和实际值相吻合,试验拟合性好,试验误差小。该研究中的变异系数为1.52%,而变异系数反映模型的置信度,其越低模型的置信度越高,说明模型方程能很好地反映真实的试验值,可用于预测酵素发酵过程中发酵液活菌数。根据模型得到的回归方程为 Rc=85.154+4.110×A+3.859×B+5.547×C-2.05×A×B-1.3×A×C-2.15×B×C-2.125×A2-4.282×B2-2.532×C2。
对回归方程的方差分析表明,因素A(低聚果糖)和B(脱脂乳粉)的交互作用(P=0.000 7<0.01)及因素B(脱脂乳粉)和C(海藻糖)的交互作用(P=0.000 5<0.01)对冷冻干燥后罗伊氏乳杆菌的存活率的影响显著。
从图1~3可以看出,响应曲面呈伞形,中心凸起,说明2因素之间的影响基本呈抛物线型关系,均有一个极大值点,呈先增大后减小的趋势。如果体系中保护剂的添加量过低,会有大量细胞裸露在介质中,在冻干时就可能改变细胞通透性,不能起到保护菌体的作用;反之,体系中保护剂太多,细胞的渗透压和通透性也会受影响,进而导致存活率下降。
以上分析表明,存在适宜的低聚果糖、脱脂乳粉和海藻糖浓度使得冷冻干燥过程中菌存活率Rc最高。最优化条件为:低聚果糖 2.66%、脱脂乳粉10.11%、海藻糖5.90%,在此条件下预测的响应值(Rc)可达89.13%。
2.2 验证试验
为验证预测值与真实值之间的拟合程度,使用上述优化条件在摇瓶水平上进行了重复验证试验:低聚 果糖 2.66%、脱脂乳粉10.11%、 海藻糖5.90%。试验按优化前和优化后的配方进行,3次重复。验证试验结果表明,优化前罗伊尔乳杆菌的存活率分别为75.8%、77.3%和73.9%(平均值为75.7%);优化后罗伊尔乳杆菌的存活率为89.4%、88.7%和90.2%(平均89.4%),较优化前提高了13.76%,说明试验值与软件预测值的拟合性良好。
3 讨论与结论
国内对罗伊氏乳杆菌冻干保护剂的研究较少。朱战波等[11]使用二次正交旋转组合设计法对1株猪源罗伊氏乳杆菌进行了冻干保护剂的优化研究,冻干存活率达到71.6%。
笔者以乳杆菌制剂的冷冻干燥工艺中的冻干存活率为研究对象,通过响应曲面法建立了冻干保护剂低聚果糖、低脂乳粉和海藻糖与存活率Rc的关系,并实现条件优化。最优条件如下:低聚果糖 2.66%、脱脂乳粉10.11%、 海藻糖5.90%,存活率预测值为89.13%。通过验证试验证实该设计方法是切实可行的,优化后罗伊尔乳杆菌的存活率达到89.43%,且与模型预测值非常接近;罗伊尔乳杆菌的存活率较优化前提高了13.76%,优于朱战波等[11]的试验结果,为罗伊氏乳杆菌冷冻干燥工艺的开发与优化提供了研究基础。
参考文献
[1]王成涛,曹雁平,孙国宝,等.产类细菌素乳酸菌的筛选及其生物学特性研究[J].中国酿造,2008(23):50-53.
[2]SUSAN F B,CATHERINE G N.Antibiosis revisited:Bacteriocins produced by dairy starter cultures[J].Journal of dairy science,1993,76(8):2366-2379.
[3]ADAMS M R.Safety of industrial lactic acid bacteria[J].Biotechnol,1999,68:171-178.
[4]庞洁,周娜,刘鹏,等.罗伊氏乳杆菌的益生功能[J].中国生物工程杂志,2011,31( 5):131-137.
[5] CARVALHO A S, SILVA J, HO P,et al. Relevant factors for the preparation of freezedried lactic acid bacteria[J].International dairy journal,2004,14(10):835-847.
[6]蒲丽丽,刘宁,张英华,等. 乳酸菌冻干保护剂及保护机理的研究进展[J].现代食品科技,2004,21(1):147-149,153.
[7]张英华,霍贵成,郭鸰. 乳酸菌冷冻干燥保护剂的筛选及加速储存稳定性试验[J].中国乳品工业,2007,35(2):8-10.
[8]WASSERMAN A E,HOPKINS W J.Studies in the recovery of viable cells of freeze-dried Serratia marcescens[J].Appl Microbiol,1957,5(5):295-300.
[9]曹小红,哈志瑞,王春玲,等.应面法对Bacllius natto TK-2产聚-γ-谷氨酸(γPGA)发酵培养基的优化[J].食品与发酵工业,2008,9(1):24-26.
[10]中国人民共和国卫生部.食品安全国家标准食品微生物学检验:GB 4789.3-2010[S].北京:中国标准出版社,2010.
[11]朱战波,刘存霞,刘宇,等.二次正交旋转组合设计优化猪源罗伊乳杆菌冷冻干燥保护剂[J].中国生物制品学杂志,2009,22(11):1091-1092.
安徽农业科学,Journal of Anhui Agri. Sci.2016,44(5):15-17
(责任编辑:单位文秘网) )地址:https://www.kgf8887.com/show-151-85735-1.html
版权声明:
本站由单位文秘网原创策划制作,欢迎订阅或转载,但请注明出处。违者必究。单位文秘网独家运营 版权所有 未经许可不得转载使用