单位文秘网 2021-08-18 09:10:34 点击: 次
农业大学园艺学院实验室进行研究。
1.2 试验方法
1.2.1 外植体的灭菌处理
将外植体用洗洁精洗净灰尘,再用流水冲洗1 h。放在超净工作台的滤纸上吸干水分,放入灭菌后的烧杯中。加75%乙醇消毒30 s,用蒸馏水清洗4次,加0.1%三氯甲烷消毒6 min,用蒸馏水冲洗5次。消毒期间不断振荡,使试剂与材料充分接触。
1.2.2 单因素试验 [HJ1.4mm]
为探究每种生长激素的不同浓度对外植体产生的影响,以MS为基本培养基,将6-BA、IBA、NAA分别设置5种浓度:6-BA(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L);NAA(0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mg/L);IBA(0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mg/L)。将外植体分别接种到培养基内,每个处理接15个茎段,培养周期为50 d。
[CM(26]1.2.3 软枣猕猴桃一步成苗培养基的优化
在单因素试验的基础上,用响应面分析法,根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理,以6-BA、NAA、IBA浓度为试验因子,植株再生频率为响应值,进行3因素3水平的试验设计,结果见表1,每个水平处理10个茎段,培养周期为50 d。
1.2.4 培养条件
基础培养基为MS培养基,加入蔗糖 30 g/L、琼脂粉8 g/L,pH值5.8~6.0。培养环境为:温度(25±2) ℃,光照度2 000 lx,每天光照14 h。
1.2.5 数据分析
采用Design-Expert 8.0.6软件对数据进行分析。
诱导率=出不定芽的外植体/接种的外植体数×100%;植株再生频率=再生植株总数/接种的外植体数。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 不同6-BA浓度对外植体的影响
6-BA是一种常用的细胞分裂素,对细胞生长分化有良好的促进作用。外植体接种15 d左右,有嫩绿色芽点产生,逐渐长大成为不定芽,30 d后部分不定芽会增殖出多个不定芽,当6-BA浓度为10、2.0、3.0 mg/L时,诱导率和增殖效果较好。当6-BA浓度为 4.0 mg/L 时,诱导率和再生频率都有所下降,可见浓度过高的 6-BA对外植体生长分化有抑制作用。50 d后,有部分不定芽长出须根,6-BA浓度为2.0 mg/L时,生根率较好,植株再生频率最高。
2.1.2 不同NAA浓度对外植体的影响
由表3可知,低浓度的NAA对诱导与增殖的效果都很差,在NAA浓度大于 0.10 mg/L 时,诱导速度慢,25 d后才有不定芽形成,形成的不定芽少。在NAA浓度为0.20,0.40 mg/L时,20 d后即可诱导出不定芽,且30 d后增殖的不定芽较多;NAA浓度为 0.80 mg/L 时,对不定芽生长有抑制作用。50 d后,部分不定芽有根系生成,其中处理B3、B4的生根效果较好。最终筛选出最适宜外植体诱导分化的NAA最佳浓度为0.20 mg/L,最佳诱导率为60.00%,植株再生频率为1.13。可见,单独使用生长素NAA对植株再生效果不佳。
2.1.3 不同IBA浓度对外植体的影响
由表4可见,IBA浓度为0.05 mg/L時,诱导和增殖效果差。IBA浓度在 0.10 mg/L 以上时,20 d后有不定芽形成,诱导率较高,不定芽较多。随着IBA浓度升高,诱导率和再生频率都升高,30 d后增殖效果较明显,50 d后,不定芽形成根且根系健壮。IBA浓度在0.80 mg/L时,再生苗的再生频率有所下降。可见,IBA诱导外植体分化的最佳浓度为0.40 mg/L,再生频率为1.27。
2.2 软枣猕猴桃一步成苗培养基的优化试验结果
2.2.1 回归方程分析
以6-BA浓度(X1)、NAA浓度(X2)、IBA浓度(X3)为自因素,以植株再生频率(Y)为响应值,根据试验结果(表5)得到回归方程为:
Y=4.10+0.44X1-0.25X2+0.29X3-0.13X1X2-0.15X1X3+0.42X2X3-0.53X21-0.80X22-0.87X23,R2=0.964 0。该回归模型的P值=0.000 3<0.01,有极显著性;失拟项F值=0.177 6>0.05,无显著性。说明该方程模型拟合度较好,试验误差较小。表6显示,X1、X12、X22、X32回归系数极显著(P<0.01),X2、X3、X2X3回归系数显著(P<0.05)。说明因素6-BA浓度对植物再生频率有极显著影响,IBA浓度与NAA浓度对其有显著影响,且NAA浓度与IBA浓度的交互作用对植株再生频率有显著性影响。6-BA浓度与NAA浓度、IBA浓度的交互作用对结果影响不显著。
2.2.2 响应面分析
通过Design-Expert 8.0.6软件绘制因素间交互作用的等高线图和响应面图,结果见图1至图3,通过等高线、响应面形状来分析因素之间的交互作用以及对再生频率的影响。其中,6-BA浓度对植株再生频率的影响最大,其次是IBA浓度,对植株再生频率影响最小的是NAA浓度。由此可以看出,存在最高点,所以最佳再生频率出现在所选因素水平的范围之内。6-BA浓度与NAA浓度、IBA浓度的响应面坡度较为平缓,对再生频率的影响不显著。NAA浓度与IBA浓度的响应面最高点位于中间,边缘形状较陡,呈明显凸字形,故NAA浓度与IBA浓度的交互作用对再生频率有极显著影响。
2.2.3 模拟方程的验证试验
通过二次回归方程的分析可得出软枣猕猴桃一步成苗的最优条件为:6-BA浓度 2.42 mg/L,NAA浓度0.27 mg/L,IBA浓度0.32 mg/L,最佳再生频率预测值为4.23。对该模型进行3次验证试验,每次处理10个茎段,得出的3次结果为4.3、3.9、4.2,平均结果为 4.13,与预测值十分接近,说明方程与真实试验拟合度较好,该优化方案有实际意义和可行度。
3 讨论与结论
关于软枣猕猴桃的组培研究,通常要经过诱导、增殖、生根的阶段,要统计诱导率、增殖率、生根率,每个阶段都须要筛选出最佳培养基,一般每个阶段需要20~30 d[13],成苗至少需要80 d。一步成苗所有阶段在1个培养基内进行,并能产生完整植株,大大节省了成本、时间、人力,是一种新型的组培方法。试验选择了6-BA、IBA、NAA 3种植物激素,其中细胞分裂素6-BA对外植体的诱导、分化、增殖有很好的促进作用,生长素IBA、NAA对植物生长、生根都有很好的效果。单因素试验中6-BA对不定芽诱导的效果要好于IBA和NAA,有研究[14]筛选出最适合软枣猕猴桃诱导的6-BA浓度是 1.5 mg/L,诱导率最高85.91%。本试验发现2.0 mg/L 6-BA诱导效果更好,可达86.67%。
一步成苗最重要的参数是植株再生频率,统计的是再生的带有根系的完整植株,不同于传统组培方法统计的增殖系数。接种30 d后,大部分植株基部有增殖的丛生芽产生,也有在茎段上增殖的现象,但这种幼嫩芽苗不计入试验结果。有研究在软枣猕猴桃增殖阶段的增殖系数最高可达5.86,高于本次试验的植株再生频率,但该试验从接种到生根阶段培养了80 d,本试验从接种到生根仅需50 d,减短了试验周期,简化了试验步骤,节省了试验成本,为软枣猕猴桃组培苗的高效工厂化生产提供了理论技术支持[13-14]。
响应面分析法是用多元二次回归方程将试验中的多种因素进行拟合,通过对响应面和等高线的分析,研究各因子与响应值的关系[15]。相对于传统试验方法,响应面是一种试验次数少、回归方程更为精准、能反映各因素间交互作用的一种高效、经济、实用的分析方法[16-17]。由优化试验得出的结果可知,最佳优化培养基为:MS+6-BA 2.42 mg/L+NAA 0.27 mg/L+IBA 0.32 mg/L,植株再生频率为4.23,高于单因素试验的最佳值1.60,说明该优化方案有可行性和实际意义。
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