单位文秘网 2021-07-09 08:18:04 点击: 次
摘要:八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是植物类胡萝卜素生物合成途径中促进番茄红素合成的关键酶,根据番茄中该酶的编码基因序列设计一对特异引物,通过RT-PCR在番茄中扩增出一个约1 900 bp的全长cDNA片段。对这个全长片段构建了超表达载体,酶切检测表明该片段已插入植物表达载体。采用农杆菌介导的方法转化番茄获得10株转基因植株,PCR检测表明外源基因已导入番茄基因组中。转基因番茄果实的番茄红素含量分析结果表明,转基因后代株系番茄红素平均含量比对照增加了1.4倍,PDS编码基因的超表达有效促进了番茄果实中番茄红素的合成和积累。
关键词:番茄;八氢番茄红素脱氢酶;超表达;载体构建;遗传转化
中图分类号:S641.2;Q78 文献标识码:B 文章编号:0439-8114(2012)02-0393-04
Construction of Overexpression Vector for Phytoene Dehydrogenase Gene and Its Expression Identification in Tomato
ZOU Li-ping,GAO He-ping,ZHONG Ya-qin
(College of Life Science and Technology,Xiaogan University,Xiaogan 432000,Hubei,China)
Abstract: Phytoene dehydrogenase (PDS) is a key enzyme in the carotenoid biosynthetic pathway. A 1 900 bp full-length cDNA fragment was amplified by RT-PCR from tomato using a pair of specific primers based on the coding sequence of PDS. Using the amplified fragment, the overexpression vector was constructed and identified by digestion with appropriate enzymes. The vector was transformed into tomato by Agrobacterium-mediated method and ten transgenic plants were obtained. The result of PCR revealed that the target gene was integrated into the tomato genome. The lycopene contents in the fruits of transgenic lines were 1.4 times higher than that of the control, suggesting that overexpression of PDS significantly enhanced the lycopene biosynthesis and accumulation in transgenic tomato fruits.
Key words: tomato; phytoene dehydrogenase; overexpression; construction of expression vector; genetic transformation
番茄红素是一种天然植物色素,是许多类胡萝卜素生物合成的中间体。番茄红素广泛存在于水果及蔬菜中,在番茄中的含量最高。
近年来国内外许多研究表明,番茄红素可以猝灭活性氧类物质,清除体内自由基,活化免疫细胞,具有防癌、抗癌作用。番茄红素能消除香烟和汽车废气中的有毒物质,可以预防和治疗心脑血管疾病,保护皮肤。番茄红素的抗氧化性能是天然类胡萝卜素中最强的,其独特的生理功能正越来越受到人们的重视[1]。
经过多年的研究,人们已基本清楚了植物类胡萝卜素的生物合成途径[2,3],也克隆了合成途径中的大多数关键酶基因[3-5],这使得人们可以通过基因工程的方法调控番茄红素的生物合成。在植物类胡萝卜素的生物合成途径中,八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是促进番茄红素合成的关键酶,该研究的目的是通过RT-PCR的方法从番茄中克隆该关键酶基因,构建超表达载体并通过农杆菌介导对番茄进行遗传转化,以增加转基因后代植株中的番茄红素含量,提高番茄果实的营养价值。
1 材料与方法
1.1 材料
番茄品种中蔬5号、大肠杆菌DH5α、植物表达载体pMV(由pBI121改造而成,即将GUS片段缺失,引入含有5′-XbaⅠ-XhoⅠ-KpnⅠ-SacⅠ-3′多酶切克隆位点的片段)由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室番茄组提供。TRIzol试剂盒购自Invitrogen公司,克隆载体质粒pMD18-T购自TaKaRa公司,第一链cDNA合成试剂盒、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶购自Fermentas公司,DNA纯化回收试剂盒及其他相关试剂购自上海生工生物工程有限公司。
1.2 方法
1.2.1 RT-PCR扩增及基因克隆 根据GenBank中番茄八氢番茄红素脱氢酶(PDS)编码基因序列(M88683)设计一对引物为F:5′-TTCAACTTCAACCCAACC-3′,R:5′-TCACCTCGCACTCTTCTT-3′。从番茄组织中抽提RNA进行反转录,获得cDNA第一链。以获得的cDNA为模板进行RT-PCR反应,反应体系为25 μL,内含1×PCR Buffer,MgCl2 1.5 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,基因特异引物0.5 μmol/L,Taq DNA聚合酶1U,模板约100 ng。反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃、1 min,56 ℃、1 min,72 ℃、2 min,35个循环;最后72 ℃延伸10 min。回收RT-PCR扩增得到的cDNA片段,克隆到pMD18-T载体上,方法见文献[6]。重组克隆测序由上海英骏生物技术有限公司完成。
1.2.2 超表达载体的构建 将含有PDS编码基因的pMD18-T载体用SalⅠ和KpnⅠ双酶切,回收小片段克隆到经XhoⅠ和KpnⅠ双酶切的pMV载体上,构建成超表达载体(图1)。将构建的载体通过电击法导入根癌农杆菌EHA105中。
1.2.3 番茄的遗传转化 番茄的遗传转化参见文献[7]。当卡那霉素抗性芽长到2~3 cm后切下抗性芽,插入到生根培养基中诱导生根。当根长到3~4 cm后将小植株开瓶炼苗3~5 d,然后移栽到花盆中。
1.2.4 转基因植株的检测及番茄红素含量测定 提取卡那霉素抗性植株及未转化植株的总DNA,用NPTⅡ引物(F:5′-AGACAATCGGCTGCTCTGAT-3′,R:5′-TCATTTCGAACCCCAGAGTC-3′)进行PCR检测。PCR反应体系和扩增程序见文献[7]。转基因植株及对照番茄红素含量测定参照万群等[8]介绍的方法。
2 结果与分析
2.1 番茄PDS编码基因的克隆
以番茄叶片第一链cDNA为模板,通过RT-PCR扩增出一大小在1 900 bp左右的片段(图2)。回收目的片段克隆到pMD18-T载体上。重组质粒经SalⅠ与KpnⅠ双酶切检测,可切下一大小在1 900 bp左右的片段(图3),证明克隆成功,命名为pMDPDS。重组子测序结果表明,所克隆的片段全长1 927 bp,其序列与GenBank中M88683的序列完全一致。
2.2 植物超表达载体的构建
选择经测序验证的正义重组克隆子pMDPDS,先用SalⅠ和KpnⅠ双酶切,再与经XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后的pMV载体连接,构建成超表达载体,定名为pMPDS。pMPDS经XbaⅠ和KpnⅠ双酶切检测,可切下一大小在1 900 bp左右的片段(图4),表明所构建的超表达载体完全正确。
2.3 转基因植株的获得与检测
采用农杆菌介导的共培养法获得了11株卡那霉素抗性再生植株,这些抗性植株与对照相比没有明显的形态学差异。以pMPDS载体为阳性对照,未转基因植株为阴性对照,利用NPTⅡ引物对卡那霉素抗性植株进行PCR的检测结果显示,10株再生植株能扩增出预期的740 bp的电泳带,而未转基因植株则无该特异带(图5),初步表明外源基因已整合到番茄的基因组中,PCR结果阳性的植株占抗性植株的比例为90.9%。
2.4 转基因植株后代番茄红素含量分析
对转基因番茄植株T1代株系测定果实番茄红素含量,结果见图6。从图中可看出,转基因植株果实番茄红素含量都比对照显著增加,最高的株系6比对照增加了2.1倍,平均增加了1.4倍。
3 小结与讨论
植物类胡萝卜素生物合成途径是重要的色素合成途径,由于植物类胡萝卜素合成途径中几乎所有的基因均已被分离和鉴定,使得利用转基因技术提高一些主要农作物中类胡萝卜素的含量成为可能。目前,植物类胡萝卜素基因工程进展很大[9-11],转基因“金稻”的培育就是一个突出的例子[12]。本研究从番茄中克隆了植物类胡萝卜素生物合成途径中促进番茄红素合成的八氢番茄红素脱氢酶(PDS)的编码基因,并构建了该基因的超表达载体,通过农杆菌介导法获得了转基因番茄植株,转基因后代株系果实中番茄红素平均含量比对照增加了1.4倍。由此可见,超表达PDS的编码基因成功地达到了增加番茄果实中番茄红素的含量和提高番茄果实营养价值的目的。
Fray等[13]的研究表明,组成型过量表达番茄PSY的编码基因导致转基因番茄植株矮化。同样,Busch等[14]的研究表明,烟草PSY的编码基因组成型过量表达,也引起转基因烟草植株矮化、叶片形态变化等不良反应。本研究中超表达载体采用的是CaMV 35S启动子,获得的10株转基因番茄植株是组成型超表达PDS的编码基因的,这些转基因植株与野生型相比没有明显的形态学差异,这与张建成等[15]的研究结果一致。在转基因研究中,人们通常选择组织或器官特异性启动子,以减少对非靶器官或组织生长的影响。Aluru等[16]利用特异性启动子,将类胡萝卜素合成途径中的3个基因PSY、PDS、ZDS同时过量表达,发现转基因玉米胚乳中积累的总的类胡萝卜素含量是对照的34倍。因此,在应用基因工程技术调控类胡萝卜素生物合成途径时,应尽量选用组织或器官特异性启动子。
参考文献:
[1] 李 京,惠伯棣,裴凌鹏. 番茄红素——被关注的功能因子[J].食品科学,2005,26(8):461-464.
[2] HIRSCHBERG J. Carotenoid biosynthesis in flowering plants[J]. Curr Opin Plant Biol,2001,4(3):210-218.
[3] 朱长甫,陈 星,王英典. 植物类胡萝卜素生物合成及其相关基因在基因工程中的应用[J]. 植物生理与分子生物学学报,2004,30(6):609-618.
[4] 陶 俊,张上隆,徐昌杰,等. 类胡萝卜素合成的相关基因及其基因工程[J]. 生物工程学报,2002,18(3):276-281.
[5] CUNNINGHAM F X,GANTT E. Genes and enzymes of carotenoid biosynthesis in plants[J]. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol,1998,49:557-583.
[6] 邹礼平,高和平,钟亚琴,等. 番茄八氢番茄红素合成酶基因的克隆及超量表达载体构建[J]. 孝感学院学报,2008,28(6):16-19.
[7] 邹礼平. 番茄抗坏血酸生物合成与代谢途径中相关酶基因的克隆与调控[D]. 武汉:华中农业大学,2005.
[8] 万 群,张兴国,宋 明. 果实特异性RNAi介导的Lcy基因沉默来增加番茄中番茄红素的含量[J]. 生物工程学报,2007,23(3):429-433.
[9] 王玉萍,刘庆昌,翟 红. 植物类胡萝卜素生物合成相关基因的表达调控及其在植物基因工程中的应用[J].分子植物育种,2006,4(1):103-110.
[10] BRAMLEY P. Regulation of carotenoid formation during tomato fruit ripening and development[J]. J Exp Bot,2002,53(377):2107-2113.
[11] GIULIANO G,AQUILANI R,DHARMAPURI S. Metabolic engineering of plant carotenoids[J]. Trends Plant Sci,2000,5(10):406-409.
[12] YE X,AL-BABILI S,KL?魻TI A,et al. Engineering the provitamin A (β-carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm[J]. Science,2000,287(5451):303-305.
[13] FRAY R G,WALLACE A,FRASER P D,et al. Constitutive expression of a fruit phytoene synthase gene in transgenic tomatoes causes dwarfism by redirecting metabolites from the gibberellin pathway[J]. Plant J,1995,8(5):693-701.
[14] BUSCH M,SEUTER A,HAIN R. Functional analysis of the early steps of carotenoid biosynthesis in tobacco[J]. Plant Physiol,2002,128(2):439-453.
[15] 张建成,周文静,邓秀新. 超表达草生欧文氏菌crtB基因促进转基因番茄类胡萝卜素合成的研究[J].园艺学报,2010,37(3):390-396.
[16] ALURU M,XU Y,GUO R,et al. Generation of transgenic maize with enhanced provitamin A content[J]. J Exp Bot,2008,59(13):3551-3562.
(责任编辑:单位文秘网) )地址:https://www.kgf8887.com/show-181-62509-1.html
上一篇:酿酒酵母的乳酸抗性机制
版权声明:
本站由单位文秘网原创策划制作,欢迎订阅或转载,但请注明出处。违者必究。单位文秘网独家运营 版权所有 未经许可不得转载使用