单位文秘网 2021-08-10 08:17:25 点击: 次
【摘要】:培养人工培养菌丝生产的虫草菌丝粉,就是百令胶囊。在这个生产过程中,主要就是菌种的培养,斜面接种、传代、保存等。培养基的制备是整个操作过程中最基础也是最重要的。虫草培养基制备主要为比例配比,溶解,调PH,分装,灭菌,定型几个步骤。虫草培养基的好坏直接影响虫草菌种生长,所以培养基的制备是整个操作过程中最基础也是最重要的。
【关键词】:人工培养;制备;虫草培养基;
天然冬虫夏草是昆虫和真菌的结合体,是虫草菌寄生于鳞翅目蝙蝠蛾[1]的幼虫生长而成。生长在海拔3500—4000以上的高山草甸区,对自然环境要求特殊,因此产量低,再加上人们盲目的采伐,资源日趋缺乏,价格昂贵,是少有的紧缺药材。通过用人工培养方法取得更多的冬虫夏草与天然冬虫夏草成分基本一致,可以替代天然冬虫夏草。人工培养冬虫夏草技术,使其成分相近,各种成分对机体的免疫调节功能已被广泛证实,而且还大大的提高了产量,价格相对便宜,可以满足更多人需求。人工培养冬虫夏草是在培养基中生长的,培养基是虫草菌种生长的环境,也是菌种生长的必备营养物质,它的好坏直接影响着菌丝的质量。培养基的制备是整个操作过程中最基础也是最重要的。
培养基是微生物生长的基础,是用人工方法将多种营养物质按微生物生长代谢的需要配制成的一种营养物质。微生物种类繁多,对营养物质的要求各异,再加上实验和研究的目的不同,培养基的组成成分也有较大的差别。
1 成分称量与溶解
百令胶囊的冬虫夏草菌种比较喜欢半固体培养基。一般以玉米粉,葡萄糖[2]为碳源;硝酸钠为无机氮源;牛肉膏、蛋白胨为有机氮源;硫酸镁为无机盐;VB1、VB2为生长因子。根据培养基配方,准确称取各种成分,放入大量杯。将以量取好的纯化水取出少量,倒入大量杯中,用玻璃棒搅拌使其溶解。把剩余的水倒入不锈钢锅加热煮沸,倒入琼脂粉5~10%继续加热至琼脂[3] 完全熔化。在加热过程中用玻璃棒不断搅拌,以防琼脂沉淀在锅底烧焦,同时也促使它溶解。待琼脂完全熔化后,将大量杯中以溶解的原料倒入锅中,继续加热,使原料充分溶解,直到微沸为止。加热时要控制火力,以免培养基爆腾而溢出容器。有些不易溶解的原料如牛肉膏,蛋白胨等可先在小容器中加少许水,加热溶解后再倒入容器中。
2 调PH
用30%NaOH溶液和30%HCL溶液调pH,用精密PH机进行测定。
预热、校准仪器后,即可用来测定培养基。先测培养基溶液温度,是否已降到与标定溶液温度相同,如果还高于标定溶液温度,等培养基溶液降温至标定溶液温度一致时再测定PH值。否则测定出的PH值是不准确的。
用馏水洗电极头部,用被培养基溶液清洗一次,按“读数”键,把电极浸入培养基溶液中,用玻璃棒搅拌溶液,使溶液均匀,在显示屏上读出溶液的PH值。
先测定培养基初始PH,如PH值偏酸,则加30%NaOH溶液,偏碱则加30%HCL溶液。反复几次调节至PH7。
其实这样用酸碱反复调PH的方法并不好,会影响培养基的成分和质量。培养基成分的原因,使培養基本身成酸性,所以直接用30%NaOH调PH。加NaOH时要慢慢地放,宁可少补,不可多。虽然这个方法比较麻烦,但是它不影响培养基的成分和质量,而且还节约了试剂。
3 分装
趁热按规定的量将培养基分装到茄型瓶、试管中。一般装容器的(20-30)%量。装量过多,培养基是多种营养物质的混悬液,大都具有粘性,在分装时要注意,不使培养基沾污瓶口或管口,以免污染棉塞,造成杂菌生长。
4 灭菌
冬虫夏草培养基采用高压蒸汽灭菌[4],主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。灭菌的时间与温度直接影响着培养基的好坏。配制完毕的培养基,因及时进行灭菌操作,若耽误了时间,会因杂菌生长[5],导致培养基变质而不能使用。特别在气温高的情况下,如不能及时灭菌,数小时内培养基就可能变质。
根据培养基的成分,用途等不同,灭菌的时间也不同。冬虫夏草菌种用的培养基用高压蒸汽灭菌锅(118-122)℃灭菌(29-31)min。
灭菌升温与降温时间不宜过长,会破坏培养基部分有效成分,并使培养基颜色变黄红色,影响菌种的生长。
灭菌注意事项,灭菌前先要排冷空气,可以提高灭菌时升温速度,以免升温时间过长,培养基长时间闷于灭菌柜中,被破坏有效成分。灭菌柜内不能放过多过挤培养基,以免部分培养基灭菌不彻底。灭菌完毕后,小排气,以免培养基冲瓶口。等灭菌柜夹层温度降至95℃,以防烫伤人员;压力降到0KPa,方可开门去培养基。
5 定型培养
待灭菌取出后,立即轻摇试管或茄型瓶,将沾在瓶内壁上的培养基轻摇洗下,并将瓶底结块摇匀,分别稀疏放入多个筐中。待培养基冷却至(35-45)℃,轻缓摇匀,管口或瓶口朝上,以15℃角倾斜在木条上静置,长度一般为试管长度的1/2—2/3,茄型瓶的2/3—3/4。摆放时注意不可使培养基沾污棉塞,冷凝过程中勿再移动试管或茄型瓶冷却至凝固。并在(30-35)℃生化培养箱内培养三天,观察是否染菌[6]。若无染菌则放入(11-15)℃生化培养箱保存备用。
通过人工培养技术,获得与天然冬虫夏草成分相近,免疫调节功能相似的人工冬虫夏草,而且还大大的提高了产量,价格相对便宜。
虽然人工培养技术已经成功,但是还不够成熟。在菌种培养的时候还是常会出现不少问题。如菌种生长稳定性不高,斜面培养生长不好,有时产量不高等。
虫草培养基就是虫草菌种生存的根源,虫草培养基的好坏直接影响着虫草菌种生长的好坏,影响着人工培养冬虫夏草的质量,影响着人工培养冬虫夏草生产的产量。虫草培养基是生存的源头,控制好虫草培养基制备,可以提高菌种生长稳定性。
参考文献:
[1] 黄风,张才军.人工培养冬虫夏草提取物免疫调节实验研究进展[J].医学综述, 2008,933(3):1006-2084.
[2] 沈萍主编.微生物学[M].北京:高等教育出版社,2000
[3] 赵斌,何绍江主编.微生物学实验[M].北京:科学出版社,2002
[4] 曹春林主编.中药药剂学[M].上海:上海科学技术出版社,1986
[5] 黄秀梨主编.微生物学实验指导[M].北京:高等教育出版社,1999
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