单位文秘网 2021-08-05 08:12:25 点击: 次
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1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2016年10月-2017年12月赣州市人民医院收治的76例符合入组条件的ED-SCLC受试者为本研究对象。其中男48例,女28例,年龄38~67岁,平均(53.2±7.6)岁。纳入标准:符合《原发性肺癌诊疗规范》(2018年版)中SCLC诊断标准[5];经医院组织病理学确诊为ED-SCLC;各项临床资料完整。排除标准:精神疾病,伴有严重认知功能障碍;合并严重心肾功能不全症状;合并其他恶性肿。本研究经医院伦理委员会审核批准实施,入选患者及其家属均知情同意并签订知情协议书。
1.2 方法
1.2.1 治疗方法 ED-SCLC受试者采用依托泊苷联合顺铂(EP)方案予以治疗:第1~3天静脉滴注依托泊苷(生产厂家:江苏恒瑞医药股份有限公司,批准文号:国药准字H32025583,规格:5 mL︰0.1 g)120 mg/m2和顺铂(生产厂家:南京制药厂有限公司,批准文号:国药准字H20103216,规格:20 mL︰20 mg)25 mg/m2治疗。共治疗3个周期,21 d为一周期,疗程结束后评估疗效。
1.2.2 CTCs分选与计数 利用严格消毒后真空采血针采集ED-SCLC患者化疗前及化疗后1、3、24、48、72 h及5 d的外周静脉血5~10 mL,迅速加入5 mL人淋巴细胞分离液,取5 mL肝素抗凝静脉血与等量磷酸盐缓冲液(PBS)稀释混匀,并将稀释液缓慢加入人淋巴结细胞分离液上层。离心20 min(4 000 r/min),随后可见离心管自下而上出现5层,CTCs位于环状乳白色单个核细胞层中,小心吸取并加入5 mL PBS液洗涤2次,再次离心10 min(2 000 r/min),再吸取试管底部细胞沉积物,置于-196 ℃的液氮中保存。采用免疫荧光染色技术鉴定CTCs并进行计数。
1.2.3 荧光定量PCR法(qRT-PCR)分析mRNA表达情况 采用qRT-PCR法(BIO-rad CFX96 touch)检测富集分离的CTCs相关基因(CK19、E-cadherin、Vimentin)的相对表达情况。将获取的血液样本加入1 mL Trizol裂解,200 μL氯仿萃取,75%乙醇洗涤,按照试剂盒说明书提取样本总RNA,随后进行逆转录反应获得cDNA(各种试剂的固定总量为5.25 μL,再加入1 μg总RNA,用DEPC-H2O补充至10 μL,逆轉录生成cDNA),最后在进行PCR扩增(反应条件:90 ℃反应30 s,95 ℃反应5 s,55 ℃反应30 s,72 ℃反应30 s。共进行40个循环,72 ℃延伸8 min)获得数据。ΔCt=Ct(待检基因)-Ct(内参基因),使用2ΔΔCt法分析比较mRNA的相对表达情况。
1.2.4 酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定蛋白浓度 使用ABclonal公司生产的试剂盒检测角蛋白-19(CK-19),使用Abcam公司生产的试剂盒检测钙离子依赖型细胞黏附素家族(E-cadherin),使用Omega公司生产的试剂盒检测波形蛋白(Vimentin),上述检测均严格按照试剂盒说明书操作完成。
1.3 观察指标与评定标准 治疗前后外周血循环肿瘤细胞数及阳性表达率,治疗前后CK-19、E-cadherin及Vimentin的mRNA表达量,治疗结束后的临床疗效。按照实体瘤疗效标准评价治疗效果,完全缓解(CR):目标病灶消失且情况稳定维持4周;部分缓解(PR):目标基线病灶最大直径总和下降30%且情况稳定维持4周;稳定(SD);目标基线病灶最大直径总和下降小于30%;进展(PD):目标基线病灶加重。临床有效率=(CR例数+PR例数)/总例数×100%。
1.4 统计学处理 采用SPSS 21.0软件对所得数据进行统计分析,计量资料用(x±s)表示,比较采用t检验;计数资料以率(%)表示,比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 治疗前后CTCs计数及细胞表型比较 ED-SCLC患者采用EP方案化疗后,CTCs计数及阳性表达率较治疗前均明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05),见表1。
2.2 治疗前后CK-19、E-cadherin、Vimentin的mRNA阳性表达情况比较 EP方案化疗后CK-19、E-cadherin的mRNA阳性表达率均较化疗前明显降低,而Vimentin的mRNA阳性表达率较化疗前升高,差异均有统计学意义(P<0.05),见表2。
2.3 治疗前后CK-19、E-cadherin、Vimentin的蛋白表达水平比较 EP方案化疗后E-cadherin、Vimentin蛋白水平较化疗前均明显降低,而CK-19蛋白水平较化疗前升高,差异均有统计学意义(P<0.05),见表3。
2.4 临床疗效 应用EP方案化疗ED-SCLC患者,疗程结束后,CR 6例、PR 40例、SD 18例、PD 12例,临床有效率为60.5%,EP方案化疗对ED-SCLC肿瘤有确切效果。
3 讨论
肺癌是一类常见的严重威胁人们生活质量及生命健康的恶性肿瘤,其发病率和死亡率随着环境的恶化正在逐年攀升。肺癌按照组织病理学划分为NSCLC与SCLC两类,其中SCLC是以生长速度快、恶性程度高、早期易发生转移及高度侵袭性为特征的肺癌,虽其对放疗与化疗敏感,但目前EP方案仍是临床救治SCLC的一线方法,多项研究证实其对SCLC有确切疗效[6-7]。笔者前期研究发现SCLC患者尤其是ED-SCLC患者,外周血中CTCs数量远超过其他肿瘤类型的CTCs计数,表明CTCs可能有不同于其他细胞的生物学特点。CTCs是自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放而进入外周血循环的肿瘤细胞,相关研究表明CTCs形成是肿瘤进展和远处转移的首要因素,在肿瘤的血行播散中起着重要的作用[8-9]。伴随现代检测技术的发展和应用,目前CTCs检测方法的敏感度和特异度不断提高,并且在其临床应用价值逐渐得到人们的重视。
EMT是指带有极性上皮细胞在特定生理或病理条件下转化变成间质细胞的过程,现有研究发现CTCs在EMT发挥了重要作用,EMT使CTCs间质化从而赋予了上皮肿瘤细胞更强的转移和侵袭能力,参与了肿瘤异质性的形成和转移过程[10-11]。EMT发生时,上皮细胞丧失极性,与周围细胞及基质接触减少,从而降低了细胞间的黏附作用,使细胞的运动迁移能力加强;此外EMT导致细胞表型发生改变,特征性表现为Vimentin、Fibronectin等间质型标志物表达上调而E-cadherin、Cytokeratin等上皮型标志物表达下调或缺失[12]。CK-19是一种上皮组织特异性标记物,为上皮特异性分布蛋白质,而非上皮组织来源的细胞、淋巴结均不表达,因此CK-19可作为肿瘤患者血中是否存在CTCs微转移的标志[13]。E-cadherin主要位于上皮细胞的紧密连接处,其表达的减少和缺失可引起细胞间粘连的改变,使得细胞迁移能力增强,引发肿瘤的侵袭和转移[14]。间质细胞标记物Vimemin对判断CTCs的转化特征具有重要意义,其表达高提示CTCs获得了间质细胞的特性,侵袭和移动性大幅增强[15-16]。这些细胞表型的变化为证实EMT的存在提供了契机,通过检测其变化情况可以判定是否发生EMT。从而推测EP方案化疗是否会对ED-SCLC患者CTCs的EMT过程产生影响,进一步证实EP方案化疗是否通过抑制CTCs发生EMT过程,从而抑制肿瘤复发及转移[17-19]。
本研究结果显示,在EP方案化疗后,CK-19、E-cadherin的mRNA阳性表达率均降低,而Vimentin的mRNA的阳性表达率升高,提示ED-SCLC患者CTCs中存在有上皮亚型、间质亚型以及发生上皮-间质或间质-上皮亚型的转变,表明EP方案化疗可能通过抑制ED-SCLC患者CTCs发生EMT过程,从而抑制肿瘤复发及转移。
综上所述,EP方案化疗可通过抑制ED-SCLC患者CTCs发生EMT过程,抑制肿瘤转移及复发,这对了解化疗药物在恶性肿瘤治疗中的具体分子机制、明确化疗在CTCs发生EMT过程的意义和地位均具有积极意义;与此同时,临床早期监测CTCs变化可能对发现肿瘤、肿瘤复发、肿瘤转移方面具有重要意义。本研究也为CTCs与肿瘤复发、肿瘤转移之间的量化对应关系、阐明肺癌具体机制提供理论依据。
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(收稿日期:2019-08-21) (本文编辑:程旭然)
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