单位文秘网 2021-07-09 08:19:04 点击: 次
农业生态。E-mail:wzjshz@163.com。
通信作者:赵志军,博士,副研究员,研究方向为代谢工程,E-mail:zhaozj@sari.ac.cn;王绍明,教授,研究方向为生态学,E-mail:westwild@vip.sina.com。
ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,简称ε-PL)是由25~35个L-赖氨酸单体通过α-COOH和ε-NH2脱水缩合而成的氨基酸同型聚合物,相对分子质量通常为3 500~4 500 Du[1]。ε-PL具有广泛的抑菌谱,并且稳定性强,安全高效,目前我国已经批准其作为食品防腐剂[2],在国外更是已被广泛应用。
近年来,我国研究人员对ε-PL产生菌的筛选[3]、发酵[4]、产物鉴定[5]、提取[6]、应用[7]等进行了大量研究。传统的筛选工作通过鉴定摇瓶发酵液中的产物来确定所筛菌株是否能够产生ε-聚赖氨酸,筛选过程费时费力,且效率极低。Nishikawa等采用一种含酸性染料polyR-478的培养基筛选ε-PL产生菌,获得了大量ε-PL产生菌,包括链霉菌属(Streptomyces)、北里胞菌属(Kitasatosporia)、香柱菌属(Epichloe)等[8];该方法大大提高了筛选效率,且可获得不同菌种的ε-PL产生菌,但因为所用染料试剂的停产,该方法未得到普及[9]。目前,我国研究人员多用亚甲基蓝平板筛选法分离筛选ε-PL产生菌,如黄莉等利用含K2Cr7O7和亚甲基蓝的平板筛选出一株Streptomyces griseolus,其ε-PL产量为0.808 g/L[10]。张波用同样的方法从四川省成都市郊区土壤中筛选获得一株ε-PL产量为1.893 g/L的不吸水链霉菌Streptomyces ahygroscopicus SAC23[11]。
江南大学[12]、天津科技大学[13]、南京工业大学[14]等单位在ε-PL菌种筛选与发酵优化方面做了大量的研究工作。张超等筛到一株Streptomyces sp. M-Z18,该菌的摇瓶ε-PL产量为0.2 g/L,其所在课题组以Streptomyces sp. M-Z18为出发菌株采用物理化学诱变、原生质体融合、基因组重排(genome shuffling)技术等一系列方法进行ε-PL高产菌株选育,2007年以该菌株为出发菌株进行紫外诱变得到一株高产ε-PL的菌株C-18,其摇瓶ε-PL产量为1.23 g/L[15]。任喜东等提出了一种酸性pH值冲击策略,先将pH值调至5.0,对pH值冲击阶段进行预适应,再调节pH值至3.0,以调控菌体代谢活力,最后调节pH值至4.0为ε-PL的积累提供最适条件,在此条件下,5 L发酵罐的发酵产量达54.70 g/L,不仅达到了商业生产要求,甚至高于日本工业生产用菌Streptomyces albulus stain 410的报道产量(48.3 g/L)[16-17]。
本研究在筛选培养基中添加ε-PL和复合抗生素抑菌剂,结合ε-PL与亚甲基蓝的静电作用形成透明圈的特性,筛选不同类型的ε-PL生产菌株,并在摇瓶及5 L发酵罐中进行发酵,对不同类型ε-PL生产菌株产ε-PL的性能进行考察。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品
2016年9月从上海市郊区采集土样,除去表层土,取距表层5~10 cm土壤100 g,装入已灭菌的牛皮纸袋中,于室温下自然风干3~10 d,碾碎过筛后,在50 ℃下烘1 h,取1 g土样加入10 mL灭过菌的0.005 mol/L磷酸缓冲液[pH值为7.0,其中含6.00%蛋白胨和0.05%十二烷基硫酸钠(SDS)]中,50 ℃下振荡10 min[18]。
1.1.2 試剂
ε-PL对照品购自郑州拜纳佛生物工程股份有限公司;酶及引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司;DNA提取试剂盒购买自碧云天生物技术有限公司;其他试剂均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 仪器
PCR仪(BIO-RAD),高压蒸汽灭菌锅(SANYO),电泳仪(BIO-RAD),SBA-40D生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所),5 L发酵罐(Sartorius Stedim Biotech GmbH),高效液相色谱仪(岛津公司)等。
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