单位文秘网 2021-08-09 08:12:17 点击: 次
摘要:利用PCR技术扩增了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Ⅲ号染色体上以ARS(Autonomously replicating sequence,ARS)305为核心的不同长度侧翼序列,并将其构建到酵母整合型载体pRS405中获得了重组质粒PA500、PA1000、PA2000,然后通过电转化法转入酿酒酵母细胞中,测定了不同ARS305片段对酵母转化效率及质粒在酵母中稳定性。结果表明,并非侧翼序列越长ARS活性越高,重组质粒PA1000具有比PA2000更高转化频率和转化稳定性,推测ARS两侧序列存在一些顺式和反式的调控机制影响ARS自主复制功能。
关键词:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae);ARS305;重组质粒;复制起始活性
中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2013)19-4804-03
真核生物染色体中存在多个复制起始位点,能够使真核生物巨大的基因组在较短时间内完成复制。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的复制起始位点称为自主复制序列(Autonomously replicating sequence,ARS),首次在酿酒酵母的TRPI基因紧密连锁DNA序列中发现,含有ARS的质粒转化酵母后能独立存在于宿主染色体外且能自主复制[1]。此后,Irene等[2]从酿酒酵母Ⅲ号染色体中共发现有19个ARS,约为150 bp,其中含有一段11 bp富含A/T的保守序列ACS[5′-(A/T)TTTA(T/C)(A/G)TTT(A/T)-3′]。然而含有保守序列ACS的不同片段在ARS活性方面却表现出明显的差异,部分活性高的ARS却没有ACS保守序列[3]。说明DNA复制起始功能不仅由ACS保守序列决定,还需核心序列3′和5′侧翼序列的参与。
在酵母遗传工程中,不考虑载体-宿主系统的类型、外源基因产物的性质和工程菌的培养条件等因素,重组质粒的稳定性可以从功能上鉴定复制起始位点的活性。通过DNA重组技术将可能含有ARS的DNA片段构建到缺失复制起始位点的质粒后转入细胞,如果它有较高的细胞转化率并且表现为遗传不稳定性,就表明该片段在宿主菌中可能有复制起始位点活性[4]。本研究扩增了以ARS305为核心的不同长度侧翼序列,并将其构建到酵母整合型载体pRS405中,通过电转化法转入酿酒酵母细胞中,测定了不同ARS片段对酵母转化效率及质粒在酵母中稳定性,为后续以酵母作为模式生物研究真核基因的复制与转录机制提供了参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 Esherichia coli DH5α为内蒙古科技大学生物工程与技术研究所基因工程实验室保藏。酿酒酵母YPH499(MATα ura3-52 lys2-801 anber ade2-101 ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1)、整合型载体pRS405由美国新泽西州医学院微生物学与分子遗传学部Newlon教授馈赠。
1.1.2 试剂 DNA Marker,限制性内切酶,T4 DNA连接酶,Taq DNA聚合酶及PCR产物纯化试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司;Agarose购自Invitrogen公司;PCR引物合成及DNA测序工作由生工生物工程(上海)有限公司完成;其他试剂药品为进口分析纯和生化试剂。
1.1.3 培养基 大肠杆菌的培养使用LB培养基(胰蛋白胨10 g/L,NaCl 10 g/L,酵母浸提物5 g/L,固体培养基琼脂含量15 g/L);酿酒酵母YPH499的培养使用YPD培养基(胰蛋白胨20 g/L,酵母浸提物10 g/L,高压灭菌20 min 后,加入100 mL灭菌的20 g/L葡萄糖溶液,固体培养基琼脂含量15 g/L)。SD 筛选培养基(1.34%YNB,2%葡萄糖,2%琼脂);氨基酸(20 mg/L Trp,20 mg/L His,20 mg/L Lys)。
1.2 方法
1.2.1 酵母基因组的提取 珠磨法提取:收集过夜培养16~18 h的酿酒酵母YPH499菌液,用TE洗涤2次溶于200 μL TE中;加入50 mg玻璃珠(直径0.3~0.5 mm)和100 μL酚∶氯仿(25∶24,V/V),漩涡振荡2~3 min;12 000 r/min离心2 min,取上清,加入等体积酚∶氯仿(25∶24,V/V),抽提后12 000 r/min离心5 min;取上清,加入0.5 μL RNaseA,37 ℃温浴30 min;加入2倍体积无水乙醇,-20 ℃静置30 min;10 000 r/min离心5 min,沉淀物用70%乙醇洗2次,自然干燥后溶于20 μL TE,以0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.2 ARS305侧翼序列的扩增 根据GenBank中酿酒酵母Ⅲ号染色体上的ARS305序列,利用Primer premier 5.0软件设计了3对特异性引物(表1),由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR 扩增反应体系总体积为 25 μL:模板DNA 2.0 μL、10×DNA Polymerse Buffer 2.5 μL、EX Taq DNA Polymerse(5 U/μL)0.5 μL、dNTPs (10 mmol/L) 2.0 μL、引物F1和R2(10 mmol/L) 1.0 μL、ddH2O 16.0 μL。PCR反应后回收目的条带,于-20 ℃保存备用。
1.2.3 酵母自主复制质粒的构建 采用限制性内切酶XhoⅠ(PstⅠ)和BamHⅠ双酶切PCR扩增纯化产物和整合型载体pRS405,分别回收目的片段和载体片段, 16 ℃条件下T4 DNA连接酶连接24 h,连接产物转化至E. coli DH5α感受态细胞,涂布于含氨苄抗性(50 μg/mL)的LB平板上,37 ℃过夜培养,提取质粒双酶切鉴定阳性克隆,同法构建另外两个重组质粒。
1.2.4 重组质粒的电转化 将纯化的质粒加入到 100 μL酿酒酵母YPH499感受态细胞中,轻柔混匀后移入预冷的2 mm电击杯中。按照文献[5]设置参数,电击后迅速加入1 mL预冷的1 mol/L山梨醇缓冲液。28 ℃静置复苏 1~2 h后加入1 mL液体YPD培养基,于30 ℃、100 r/min下培养1 h。浓缩培养液,将其均匀涂布于含100 μg/mL亮氨酸的YPD平板上,30 ℃避光下培养,得到转化子。再从酵母转化子中提取质粒DNA,转化入E. coli DH5α感受态细胞中,抽提质粒 DNA 并进行双酶切鉴定。
2 结果与分析
2.1 ARS305侧翼序列的扩增
PCR产物经 0.8%的琼脂糖凝胶电泳后发现,所扩增片段分别为1 200、1 700、2 300 bp,与预期大小相符(图1)。
2.2 酵母自主复制质粒的构建及检测
酵母整合型质粒pRS405可以在大肠杆菌中复制,氨苄青霉素抗性基因可作为筛选标记。但它不能在酵母中复制,只有通过重组到酵母染色体上才能随染色体的复制而复制。pRS405带有LEU基因可作为在酵母LEU基因缺失株中的筛选标记。将扩增的目的片段插入到酶切的pRS405载体中以检测ARS305侧翼序列自主复制活性。挑取单菌落,接种于氨苄抗性液体培养基,37 ℃过夜培养,碱裂解法提取质粒。经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定,电泳结果与预期大小相符(图2),表明成功构建了自我复制型载体PA500、PA1000、PA2000。
2.3 ARS功能质粒丢失率的测定
酵母转化效率是鉴定自主复制活性强弱的直接指标。将质粒PA500、PA1000、PA2000定量转化酵母。结果表明,尽管这些片段均有ARS活性,但酵母转化效率存在一定差异,且质粒PA1000比PA2000有更高的转化频率。
由于含有 ARS 片段的质粒在酵母细胞内独立复制,并非整合到酵母染色体上,所以在细胞分裂过程中,就存在质粒丢失问题。将含有质粒PA500、PA1000、PA2000的酵母于完全YPD培养基中经约8代培养(16 h),经计算质粒PA500每代的丢失率为16.2%,质粒PA1000 每代的丢失率为10.7%,质粒PA2000每代的丢失率为13.8%。这说明它们在酵母中都是不稳定的(表2)。
3 小结与讨论
尽管真核生物的复制在进化中有很强的保守性,但不同物种的DNA复制起始位点之间却缺少明显的一致序列或结构。酿酒酵母的复制起始位点由11 bp的ACS保守序列和几个辅助序列(B区)组成。ACS是复制起始识别蛋白ORC结合位点。ACS的侧翼序列不保守,但其对ARS的活性却是非常重要的[7]。
虽然在酵母中大多数ARS都有ACS,但其中有些位点的使用频率比其他位点的更高,且有一些潜在的复制起始位点在正常生长条件下从不使用,而一旦这些潜在的复制起始位点序列克隆到质粒上,都能有效地作为复制起始位点行使其功能。因此,在酵母细胞核中染色体的环境诸如核小体定位、染色质修饰、ARS序列特征等能决定哪些潜在的位点被用作起始点以及使用的频率。Theis等[3]研究发现当敲除Ⅲ号染色体上其他高活性ARS,ARS308复制起始活性大大增强。Eaton等[8]等利用高通量列分析测定了酵母体内ARS两侧的核小体定位图谱,发现酵母复制起始位点ARS两侧核小体分布具有一定的规律,复制起始识别蛋白ORC的结合也需要ARS两侧精确的核小体定位。
本研究扩增了酿酒酵母Ⅲ号染色体有活性的ARS305及以ARS305为核心不同长度的侧翼序列,并将目的片段构建到酵母整合型载体pRS405中获得重组质粒PA500、PA1000、PA2000。酵母电转化试验发现ARS活性不仅受ACS元件控制,其旁侧序列对其活性也有重要影响,且并非侧翼序列越长活性越高(PA1000具有比PA2000更高转化频率和转化稳定性),推测延长的1 000 bp序列为ARS305活性负调节元件,与相应的反式作用因子共同调控ARS305活性,因此ARS功能并不完全依赖于ACS和解链程度,可能涉及一些顺式和反式的调控机制。
参考文献:
[1] STRUHL K,STINCHCOMB D T,SCHERER S, et al.High-frequency transformation of yeast autonomous replication of hybrid DNA molecules[J].Proc Natl Acad Sci,1979,76(3):1035-1039.
[2] IRENE C, MACLARLELLO C, NEWLON C S, et al. Identification of the sequences required for chromosomal replicator function in Kluyveromyces lactis[J]. Molecular Microbiology,2004,51(5):1413-1423.
[3] THEIS J F, DERSHOWIZ A, IRENCE C, et al. Identification of mutations that decrease the stability of a fragment of Saccharomyces cerevisiae chromosome III lacking efficient replicators[J].Genetics,2007,177(3):1445-1458.
[4] 张 迪,霍克克.真核 DNA复制起始点的结构与功能研究进展[J].高技术通讯,2003,13(12):98-102.
[5] SAMBROOK J, RUSSELL D V. Molecular Cloning: A Laboratory Manual[M]. 3rd edn, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001.132-134.
[6] 李 宏,杨予涛,张可伟,等.6个植物MARs序列的ARS功能鉴定与分析[J].科学通报,2003,48(24):2544-2549.
[7] MARILLY M.Structure function relationships in replication origins of the yeast Saccharomyces cerevisiae:Hinger order structural organization of DNA in regions flanking the ARS1consensus sequence[J]. Molecular & Genetics,2000,263(5):854-866.
[8] EATON M L, GALANI K, KANG S, et al. Conserved nucleosome positioning defines replication origins[J]. Genes & Development,2010,24(8):748-753.
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